体细胞核移植技术在转基因动物研究中的应用

利用基因工程技术将目的基因整合入动物体细胞染色体中，并将其作为供体核移植入受体－－去核卵母细胞构成重建胚，然后将其移植入假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到经定向遗传修饰的转基因克隆动物。本文就这一领域的发展历史、研究现状、应用前景及存在的问题等方面作一概述。     

体细胞核移植生产梅山猪

本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250 bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2、G3、G4和G5代的融合效率差异不显著(P>0.05),但G5代作为供体细胞核移植的重组胚胎卵裂率显著高于G1、G2、G3和G4代(P<0.05);使用G5代的胎儿成纤维细胞作为供核细胞,通过手术移植的方法,将重构胚胎移植到二元后备母猪体内,结果成功地获得了体细胞克隆梅山仔猪,并且仔猪全部为雄性胎儿,说明该性别鉴定方法不但操作简单,而且准确度高;经微卫星DNA 多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为中国优质猪品种改良、保种、性别控制及建立人类疾病模型等研究提供有效可行的方法,为批量生产克隆优秀种猪提供了坚实的理论基础。     

猪体细胞核移植研究进展

动物克隆技术对于优良种畜的复制、减少实验用动物数目、动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育以及人类疾病的治疗都具有重要的意义。文章主要介绍了影响体细胞克隆猪的几个因素,涉及胞质受体的选择与去核、供核细胞的选择与移植、激活、重组胚移植以及供体细胞与受体卵母细胞的细胞周期的同步化等。     

猪体细胞核移植研究进展

动物克隆技术对于优良种畜的复制、减少实验用动物数目、动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育以及人类疾病的治疗都具有重要的意义。文章主要介绍了影响体细胞克隆猪的几个因素,涉及胞质受体的选择与去核、供核细胞的选择与移植、激活、重组胚移植以及供体细胞与受体卵母细胞的细胞周期的同步化等。     

体细胞核移植生产转基因牛胚胎的研究

为了优化利用体细胞核移植生产转基因牛早期胚胎的体系,以携带绿色荧光蛋白-新霉抗性双标记基因的pMSCV质粒转染的胎牛耳成纤维细胞为供体,以体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚,研究供体细胞的传代次数对转基因胚的影响和重构胚在不同电场条件下（电场强度、直流电脉冲次数）融合效率及其在不同体外培养系统中的发育效果。结果表明：传代5次的细胞做核供体较有利于转基因胚的发育;在电场条件为电场强度1.6 kV/cm、直流脉冲1次的融合率最高;负压单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率较好,与未转基因体细胞核移植胚的发育相比无显著差异（P〉0.05）。     

体细胞核移植技术在猪育种上的应用

基因工程带动了生物工程的迅猛发展,转基因技术在改良家禽品种上得到广泛的应用.本文就体细胞克隆猪的关键技术加以论述.     

影响猪体细胞核移植效率的因素

卵母细胞对猪核移植效率的影响,包括卵泡直径、成熟培养前卵母细胞正确的分级、体外成熟培养液、激素等;供体细胞对猪核移植效率的影响,包括细胞类型的选择、供体细胞所处的细胞周期;不同核移植方法的影响,包括去核方法、融合方法、激活。     

转基因植酸酶玉米主要营养成分及其猪消化率的测定

首先,采用国标法对转基因玉米中概略养分、氨基酸、矿物质、维生素和脂肪酸含量进行分析;然后,采用完全随机区组设计将18头杜×长×大三元杂交公猪按体重和窝别随机分成2组,分别饲喂转基因植酸酶玉米和非转基因玉米组成的饲粮,测定概略养分和能量的消化率。结果表明,转基因植酸酶玉米的植酸酶活性(7134 FTU/kg干物质)显著高于非转基因玉米植酸酶活性(126 FTU/kg干物质);转基因植酸酶玉米中非植酸磷含量比非转基因玉米高1倍,其他营养成分含量与非转基因玉米基本相近。两种玉米粗蛋白质和粗脂肪表观消化率无显著差异(P>0.05),而其他营养物质消化率转基因植酸酶玉米均显著高于非转基因玉米(P<0.05)。因此,在猪饲粮配制中,如果用转基因植酸酶玉米替代非转基因玉米,将提高饲粮消化能值和非植酸磷含量,从而减少无机磷源的添加量。     

体细胞核移植技术生产转基因猪在我国已发展成熟

2007年岁末，在东北农业大学，一头绿色荧光转基因克隆猪顺利产下11个“猪宝宝”，其中2头具有绿色荧光特征。有关专家称，这次试验的成功标志着中国通过体细胞核移植技术生产转基因猪已经发展成熟。     

植酸酶转基因猪成纤维细胞系的构建

本研究旨在获得对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性的植酸酶转基因猪成纤维细胞系.本研究首先检测了转植酸酶基因的酵母发酵液分别经不同浓度、pH2.0的胃蛋白酶和不同浓度、pH7.0的胰蛋白酶处理后的酶活残余量;然后采用流式细胞术筛选了慢病毒转染的阳性猪成纤维细胞,并进行鉴定.结果表明,酵母粗酶液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,残留酶活分别保持在70％和80％以上;包装后的慢病毒滴度为3.75×107,经流式细胞术筛选的转基因细胞阳性率为1.2％,PCR和RT-PCR结果表明,植酸酶基因已整合到基因组上,且该基因在转录水平上表达.本研究为制备植酸酶转基因细胞系提供了一种快速有效的方法,为转基因猪的培育奠定了基础.     

卵母细胞核因子促进核移植四倍体胚胎早期发育研究

研究旨在探讨猪卵母细胞核因子在重编程过程中发挥的作用。将体细胞引入未去核的MⅡ期卵母细胞中,构建体细胞核与卵母细胞核共存的核移植四倍体胚胎。通过分析核移植四倍体胚胎的早期发育情况探讨卵母细胞核因子对核移植四倍体胚胎早期发育的影响。结果显示,核移植四倍体胚胎、孤雌二倍体胚胎及孤雌单倍体胚胎这3组胚胎的卵裂率极显著高于核移植二倍体胚胎（P<0.01）,且核移植四倍体囊胚率及总细胞数也极显著高于核移植二倍体囊胚（P<0.01）。与通过标准核移植程序构建的核移植二倍体胚胎相比,核移植四倍体胚胎具有更强的发育能力。本研究建立了一个体细胞核与完整卵母细胞核因子物质共存的四倍体胚胎模型,有助于研究供体核与卵母细胞核之间的联系,为研究核因子在重编程过程中发挥的作用提供了平台。     

Study on Oocyte Nuclear Factor Promotes the Early Development of Tetraploid Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos

The study was aimed to investigate the role of porcine oocyte nuclear factors during reprogramming. Somatic cell nuclei was introduced into intact MⅡ oocytes to establish tetraploid somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos containing both somatic nuclei and oocyte nuclei. And then the influence of the oocyte nucleus on tetraploid SCNT embryo development was examined by assessing characteristics including cleavage rate and blastocyst rate. The results showed that the cleavage rate of tetraploid SCNT embryos,diploid parthenogenetic embryos and haploid parthenogenetic embryos was extremely significantly higher than that of standard diploid SCNT embryos (P<0.01). The blastocyst rate and the total number of cells in tetraploid SCNT embryos were extremely significantly higher than that of standard diploid SCNT embryos (P<0.01).Overall,tetraploid SCNT embryos had a higher developmental competence than standard diploid SCNT embryos. In conclusion, the embryonic model was established in which a fetal fibroblast nucleus and an oocyte M Ⅱ plate coexist. Tetraploid SCNT represented a new research platform that was potentially useful for examining interactions between donor nuclei and oocyte nuclei. This platform should facilitate further understanding of the roles played by nuclear factors during reprogramming.     

提高猪核移植效率的研究进展

哺乳动物体细胞核移植(克隆)经过多年的发展,获得了多种后代。猪的核移植研究意义重大,应用价值颇高,是当今生物技术的热点研究之一。尽管猪核移植已取得了很大进展,但移植效率依然很低。本文就目前已有的资料,综述了提高猪体细胞核移植效率的各项技术环节的研究进展。     

基因打靶与体细胞克隆技术制备乳腺生物反应器的研究进展

在动物乳腺生物反应器研究中,传统方法不可避免地造成基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高且差异较大。而基因打靶在外源基因定点整合、消除位点效应方面具有明显优势。体细胞核移植技术可以提前在细胞水平对转基因动物进行筛选,不但可以节省时间,更降低了制备乳腺生物反应器的成本。作者简述了基因打靶与体细胞核移植技术结合制备乳腺生物反应器的优越性、存在问题、解决办法及其应用前景和展望。     

猪卵母细胞化学辅助手工去核及手工核移植胚胎发育能力因素的研究

本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系.观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较了化学辅助手工去核法和荧光染色去核法、不同类型的供体细胞(颗粒细胞、新生巴马肌肉成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)和供体细胞的不同处理方法(70％～80％汇合、血清饥饿法和100％接触抑制法)对重构胚发育能力的影响.结果表明:(1)利用DC诱导去核,对体外成熟培养44 h的卵母细胞以浓度0.4 μg· mL-1作用0.5～1 h为宜.(2)用DC化学辅助手工去核与用荧光染色去核的重构胚囊胚发育率差异不显著(13.11％ vs 9.25％,P＞0.05).(3)以胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞为供体构建的重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率均差异不显著(P＞0.05).(4)用70％～80％汇合(对照组)组、接触抑制组和血清饥饿组的细胞作供体构建的重构胚,在融合率上,接触抑制组显著高于对照组(P＜0.05);在分裂率与囊胚率上,各组之间均无显著差异(P＞0.05).研究结果表明,化学辅助手工去核法在实际生产中可以替代荧光染色去核法,能省去去核过程中荧光染色及紫外光照射去核等步骤,从而简化了猪手工体细胞核移植程序,提高了猪手工体细胞核移植效率,能为高效的猪手工体细胞核移植技术体系的建立提供参考.     

Factors Affecting the Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos in Cattle

Nuclear transfer is a complex multistep procedure that includes oocyte maturation, cell cycle synchronization of donor cells, enucleation, cell fusion, oocyte activation and embryo culture. Therefore, many factors are believed to contribute to the success of embryo development following nuclear transfer. Numerous attempts to improve cloning efficiency have been conducted since the birth of the first sheep by somatic cell nuclear transfer. However, the efficiency of somatic cell cloning has remained low, and applications have been limited. In this review, we discuss some of the factors that affect the developmental ability of somatic cell nuclear transfer embryos in cattle.     

猪卵丘细胞核移植研究

以卵丘细胞为供核体细胞,采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植,对去核、激活和培养等关键技术过程进行研究,结果表明,①点压法、挤压法对卵母细胞去核率明显高于盲吸法(三者分别为62.5%,64.6%,50.7%,P<0.05)。盲吸法去核染色体容易发生位置偏离,影响去核效果,但对早成熟的卵母细胞(36h～44h)进行去核可明显提高去核效率(P<0.05),在成熟培养36h～38h、39h～41h、42h～44h去核率分别为60.9%、67.8%、64.3%,而45h～48h为48.4%。②体细胞预激活有助于提高核移胚卵裂率(28.0%,20.1%,P<0.05)。A23187(Ca2 ionophore,钙离子载体)单独或与6DMAP(6Dimethylaminopurine,6二甲基氨基嘌呤)联合作用能使猪体细胞核移胚激活继续发育。③核移胚以胚胎培养液NCSU23(NorthCarolinaStateUniversity23medium,北卡洲立大学培养液23)及卵丘颗粒单层共培养体系进行分别培养,核移胚卵裂率无明显差异(30.06%,31.5%,P>0.05)。但NCSU23培养4细胞后发育能力更高(13.5%,3.9%,P<0.05)。     

不同电融合条件对莎能奶山羊转基因(GFP)核移植胚胎发育的影响

以莎能奶山羊（Saanen dairy goat）转基因（GFP）成纤维细胞为核供体细胞，以普通山羊卵母细胞为受体细胞进行了核移植，试验中对转基因核移植胚胎的电融合条件进行了优化，发现对于莎能奶山羊转基因（GFP）重构胚胎的处理，电融合时方案B（1．5kV／cm、3μs／次、间隔1s）电融合参数最适合用于莎能奶羊的转基因（GFP）核移植胚胎，其重构卵电融合率为89．4％，重构胚分裂率为68．0%。     

绵羊卵丘细胞细胞周期同步化对核移植胚胎发育的影响

供体细胞周期同步化是影响体细胞核移植成功率的重要因素之一.试验分别对绵羊卵丘细胞采用血清饥饿和接触抑制的方法进行细胞周期同步化处理,使用流式细胞仪检测各组细胞周期的分布.结果发现,与对照组相比,卵丘细胞经血清饥饿24~72 h后,显著地增加了G₀/G₁期细胞的百分比(P <0.05);接触抑制24~72 h,G₀/G₁期细胞所占比例与血清饥饿组无显著差异(P >0.05),但显著高于对照组(P <0.05);用经血清饥饿与接触抑制的供体细胞进行核移植后,重构胚卵裂率、桑椹胚率和囊胚率差异不显著(P >0.05),但二者囊胚率显著高于对照组(P <0.05).上述结果证实,血清饥饿和接触抑制均能使绵羊卵丘细胞周期同步化至G₀/G₁,均可用作绵羊体细胞核移植的供体细胞细胞周期同步化处理.