5株鸡源新城疫病毒F基因特性分析

为调查山西省鸡源新城疫病毒(NDV)的流行现状,2012—2013年从山西省部分地区的发病鸡群分离、鉴定出5株NDV,并对这5株NDV的分子生物学特性进行了研究。对各分离株F基因序列的分析表明:其中的4株病毒在基因型分类上属于基因Ⅱ亚型,并与标准弱毒疫苗La Sota株高度同源,为99.2%⁹9.4%。氨基酸序列同源性为100%,且裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,符合弱毒株裂解位点特征。另一分离毒株在基因型分类上与JS/5/01/Go同属基因Ⅶd亚型,两者基因序列同源性为95.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。其裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,为强毒株裂解位点特征。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。     

新城疫病毒云南分离株F基因变异特性分析

采用RT-PCR技术对云南2007年-2009年采集的948份喉气管拭子或组织样品中新城疫病毒F基因进行检测,获得阳性样品65份,选择30份代表性阳性样品采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,新城疫病毒云南分离株F基因核苷酸与疫苗LaSota株之间的同源性为70.5%～99.8%,与F48E9株之间的同源性为70.7%～90.8%。系统发育分析表明,30株病毒中21株属于基因型Ⅶ,裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F,与传统认为强毒裂解位点氨基酸序列相同;7株属于基因型Ⅱ,5株裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R-L,属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征,2株裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F属于强毒裂解位点氨基酸序列;2株病毒与9个基因型的同源性差异较远。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的分离及基因组分析

本研究从2008山东表现神经症状的某新城疫疫苗免疫鸡群中分离到一株病毒。通过鸡红细胞凝集试验和血凝抑制试验,表明为新城疫病毒,将其命名为ck/CH/LSD/08-29。根据GenBank上登录的新城疫病毒基因组序列,设计14对引物经过RT-PCR扩增病毒感染的尿囊液,同时应用3'-RACE和5'-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列。结果表明,该毒株基因组由15186个核苷酸序列组成,编码6种结构蛋白,在RNA上的顺序依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'。F基因裂解位点处的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点。通过F基因裂解位点附近高变区389个核苷酸序列构建遗传进化树,证明该毒株在分类地位上属于基因Ⅱ型。此外,病毒感染SPF鸡试验证明ck/CH/LSD/08-29毒株属于强毒嗜神经型毒株,能引起SPF鸡高致死率。     

一株基因Ⅸ型鸭源新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

从广东地区疑似患有新城疫的病死雏番鸭群中分离到1株新城疫病毒,命名为GD1002株。毒力测定结果表明,致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为56.0 h、1.64、2.29,符合强毒株的毒力判断标准。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段,并进行了克隆与序列分析。该分离株F蛋白裂解位点的组成为¹¹²R-R-Q-R-R-F¹¹⁷,具有典型新城疫强毒株的分子特征。F基因第47-420 nt片段基因分型分析表明,该流行株属于基因Ⅸ型。相似性及遗传进化分析结果表明,该分离株与基因Ⅸ型毒株F₄₈E₉、JS/1/97/Ch和FJ/1/85/Ch株有较高同源性和较近的亲缘关系。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析

采用异硫氰酸胍／酚／氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株及２个东北地区分离株ＤＢ３、ＤＢ５基因组ＲＮＡ,并以其为模板经反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第１链,再利用ＰＣＲ技术分段增出Ｆ基因的ｃＤＮＡ。Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和ＤＢ５株Ｆ基因的ｃＤＮＡ经酶切修饰后,插入ｐＵＣ１９的多克隆位点中,转化感受态Ｅ。ｃｄｉ ＤＨ５ａ,经相对分子质量比较、酶切分析及ＰＣＲ等鉴定方法筛选出Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和     

新城疫病毒Lasota株F基因的克隆和序列分析

本试验采用RT-PCR方法对NDV Lasota株的全长F基因进行了扩增与克隆，并对其进行测序。扩出的F基因核苷酸长度为1664bp，单一的开放阅读框编码553个氨基酸的长肽，序列中有6个糖基化位点，13个半胱氨酸残基，包括完整的F1片段和完整的F2片段。裂解位点区(112-117aa)氨基酸序列为Gly-Arg-Gin-Gly-Arg-Leu，与所有弱毒株在这一区域的序列(Gy-Arg／Lys-Gin-Gly／Ser-Arg-Leu)相符。同源性分析表明，Lasota株F基因与已发表的其它NDVF基因相比，核苷酸序列同源性在88％-99％之间，推导的氨基酸序列同源性在90％～99％之间。     

新城疫病毒HeB02分离株F基因的序列分析

根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列，设计了1对引物，并以RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒HeB02分离株的F基因，基因产物大小为1．63kb，与设计相符。对其进行序列测定后，与其他标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行了同源性比较，结果表明，HeB02株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗株LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1％、84.9％和83.8％。由此可以看出，HeB02分离株与标准毒株和疫苗株相比，在F基因上发生了变导。     

广东地区8株鹅源基因Ⅻ型新城疫病毒F蛋白基因遗传进化分析

为了解当前广东地区鹅群新城疫病毒(NDV)遗传进化情况,本研究从广东养殖病死鹅组织样品中分离鉴定获得8株NDV,对分离株的F蛋白基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。8株分离病毒之间F蛋白基因同源性较高,为96.3%-99.9%,但与当前国内NDV优势流行株及疫苗株同源性均较低。遗传进化分析结果显示所有新分离株均属于Ⅻ型NDVⅫb亚型分支,而当前国内NDV的优势流行株及常用疫苗株均属于Ⅶd亚型分支。氨基酸序列分析结果显示,本研究分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为~(112)K/RRQKR/F~(117),符合强毒株分子特征;与基因Ⅶ型代表株NDV/ZJ1相比,新分离株F蛋白B细胞中和抗原表位均出现D~(170)N变异;而与2010年～2011年报道的广东Ⅻb亚型分离株相比,新分离株F蛋白疏水区、七肽重复序列等区域均出现氨基酸的变异。综上所述,本研究分离鉴定的8株鹅源NDV的F基因均属于Ⅻb亚型,与Ⅶd亚型流行株及常用疫苗株F基因同源性较低,且其多个氨基酸关键位点存在变异。本研究在国内首次从病死鹅体内分离到基因Ⅻ型NDV,为进一步了解基因Ⅻ型NDV在广东地区水禽中的流行、病原进化以及疫苗株更新提供参考。     

新城疫病毒Sddy-02株F基因的克隆及序列分析

将山东省东营地区分离的新城疫病毒(Sddy-02)，用RT-PCR扩增裂解位点前后的F基因363bp片段，同时进行克隆和序列测定分析。参考国内外已发表新城疫各代表株，以363bp绘制了NDV系统发育进化树，并分析其遗传关系。结果表明：Sddy-02株与已发表的NDV各代表株的核苷酸序列同源性为84％～98％；氨基酸序列分析表明该株为强毒株；进化地位为基因Ⅶ型。本研究初步揭示了新城疫的流行规律，为制定控制新城疫方法提供了有益参考和依据。     

新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析

本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。     

一株新城疫基因Ⅶ型病毒株的分子生物学鉴定

从鹤壁某患病鸡群中分离到一株病毒（ＨＢ９７）,该病毒用单克隆抗体鉴定为新城疫强毒株。但其抗原性与新城疫Ｆ４８Ｅ８株有明显差异。经过对Ｆ基因的扩增、克隆、测序及与其他毒株的 Ｆ基因序列比较,表明该毒株为新城疫基因Ⅶ型。这为更好地控制和预防新城疫提供了依据。     

新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列

本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ,单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点,其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内,有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基,３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ）,这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外,其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。     

新城疫病毒V4株F基因的克隆与核苷酸序列分析

本试验采用RT_PCR方法对NDVV4 克隆株V4(Hr)的F基因进行了扩增与克隆,并以Sanger’s 双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列,推导出氨基酸序列。F基因全长为1662bp,单一的开放阅读框编码553 个氨基酸的长肽。F蛋白的疏水构型有3 个强疏水区;F蛋白上共有12 个Cys 残基位点和5 个潜在糖基化位点。同其亲本毒株Queensland 相比,核苷酸同源率为99.3% ,氨基酸同源率98.7% 。上述主要功能区的序列完全一致,但其中7 个氨基酸的不同,的确导致了二级结构的变化(主要表现为α_螺旋、β_折叠、β_转角和β_卷曲的数量和位置的不同),而且单一的氨基酸差异足以导致二级结构的变化,如:214位的P对L的替换,就导致212 ～215 位连续的β_折叠变为一个α_螺旋和一个β_转角     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662 bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

一株野鸭源新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的F基因序列设计了1对特异性引物,成功地对其中一株野鸭源NDV的F基因进行了克隆、测序,并推导其氨基酸序列,选择F基因部分片段绘制了遗传进化树。F基因全长1 662 bp,单一的阅读框架编码553个氨基酸,构成的F蛋白上有13个Cys残基位点和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-116R-117F。遗传进化分析表明,该NDV分离株为基因Ⅶ型NDV,与近年来我国家禽中所报道的NDV的基因型相一致。     

鸵鸟源新城疫病毒TN株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术对1株鸵鸟源新城疫病毒TN株融合蛋白基因(F基因)进行扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定,并与国内外NDV毒株对应序列进行比较分析.结果表明,TN株F基因的长度为1 662 bp,可编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,为1株新城疫弱毒株;与贵州省其他禽源(包括肉鸡、蛋鸡、越南斗鸡、七彩山鸡和鸽子等)毒株间的核苷酸同源性为84.0%～89.6%,氨基酸同源性为87.5%～92.1%;与国内外NDV代表株(Lasota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW2000株)的核苷酸同源性为84.4%～98.6%,氨基酸同源性为88.3%～98.0%.经系统发生树分析,TN株与NDV弱毒株Lasota株和B1株在同一分支上,属于基因II型NDV.     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

新城疫病毒F48E9株融合蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出新城疫病毒国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的融合蛋白基因的ｃＤ－ＮＡ。经双粘端定向克隆到ｐＵＣ１９的多克隆位点中,采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧末端终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２个ｂｐ,单一的开放阅读框编码５５３个氨基酸的多肽。Ｆ蛋白的疏水构型有三个强疏水区;其裂解位点的氨基酸序列为１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｒ－１１６Ｒ－１１７Ｆ;Ｆ蛋白上共有１２个Ｃｙｓ残基位点和五个潜在糖基化位点。