新疆南疆和田羊、卡拉库尔羊毛囊KAP7基因的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种（系）绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7（keratin associated protein 7,KAP7）基因多克隆抗体,为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因,构建pMD19-T-KAP7克隆质粒,对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析,再构建pET-28a（+）-KAP7原核表达重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清,并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明,与美利奴羊比对,平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%,但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C,造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg;山区型和田羊第70位碱基由A变为C,造成其24位氨基酸由Thr变为Ala;卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%,其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a（+）-KAP7可以在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达目的蛋白,其大小约为10 ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性,其抗体效价达到1：10 000。     

山区型和田羊毛囊KIF2.9基因的克隆与生物信息学分析

为了探究毛囊KIF2.9基因对半粗毛型地方品种绵羊羊毛品质和性状的影响,试验以山区型和田羊为试验动物,提取毛囊总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增毛囊KIF2.9基因,并定向插入pMD18-T克隆载体中构建pMD18-T-KIF2.9克隆质粒,经双酶切、PCR鉴定及测序分析正确后,将山区型和田羊毛囊KIF2.9基因连接到原核表达载体pET-28a(+)中,构建毛囊KIF2.9基因的pET28a(+)-KIF2.9原核表达重组质粒,检测其正确性,并运用DNAMAN、ProtParam、ExPASy、MEGA 5.0等软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:山区型和田羊毛囊KIF2.9基因编码序列大小为1 527 bp,编码509个氨基酸。与GenBank中美利奴羊比较,毛囊KIF2.9碱基序列有20处碱基发生突变,但仅造成第292位丙氨酸→缬氨酸,第414位谷氨酰胺→谷氨酸,第466位色氨酸→苏氨酸这3处氨基酸的变异。与美利奴羊毛囊KIF2.9基因的序列比对,其碱基同源性为98.69%,但氨基酸序列同源性高达99.41%。与美利奴羊毛囊KIF2.9基因蛋白结构比对,蛋白质一级结构中原子总数、分子质量、脂肪酸系数略高于美利奴,氨基酸数目、等电点、平均疏水性等无明显差异;蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链所占比例没有明显差异;蛋白质三级结构中某些肽段结构发生了变化。KIF2.9基因分子系统进化树反映山区型和田羊与美利奴羊亲缘关系较近。说明山区型和田羊与美利奴羊的羊毛类型有差异,但毛囊KIF2.9基因在氨基酸水平上高度相似,亲缘关系较近。     

辽宁绒山羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8.1基因表达研究

本试验通过Real-time PCR研究辽宁绒山羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白(KAP)8.1基因相对表达量,并与其他3个品种羊进行对比,从而明确角蛋白关联蛋白8.1基因对绒山羊皮肤毛囊发育及毛纤维品质的调控作用。结果表明,角蛋白关联蛋白8.1基因可在辽宁绒山羊皮肤毛囊内表达,相对表达量上调1.2倍。不同品种毛绒用羊角蛋白关联蛋白8.1基因m RNA相对表达量为:辽宁绒山羊南非肉用美利奴羊(♂)×东北细毛羊(♀)(简称南×东)南非肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)(简称南×寒)东北细毛羊(♂)×小尾寒羊(♀)(简称东×寒)(毛纤维直径:东×寒南×寒南×东辽宁绒山羊)。由此可见,毛纤维直径越细,角蛋白关联蛋白8.1基因m RNA相对表达量越高。说明角蛋白关联蛋白8.1基因可能对辽宁绒山羊毛纤维的细度具有一定的调控作用。     

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。     

新疆细毛羊KAP6.1基因的克隆及序列分析

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)6.1(登录号为AY483218.1)基因序列设计合成2个特异性引物,以新疆细毛羊为研究对象,从采集的皮肤组织中提取RNA进行RT-PCR反应,扩增出长度为320 bp的特异性片段,回收目的片段并连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行分析。结果表明:试验成功克隆了新疆细毛羊KAP6.1基因,得到的长度为320 bp序列中包含252 bp的编码区序列。新疆细毛羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊同源性为94.8%,有13处核苷酸差异与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。     

不同毛色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中黑色素分布及ASIP蛋白的表达定位

为了研究ASIP基因在中国美利奴细毛羊被毛颜色形成过程中的作用机制，试验分别选取体况良好的3只野生型纯白色中国美利奴细毛羊，20只纯白色、8只棕色和10只黑色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊背部的皮肤组织，通过H.E.染色对比样本皮肤组织结构及黑色素分布差异；采用免疫组织化学染色检测ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊白色、棕色、黑色3种皮肤组织中ASIP蛋白的表达定位情况。结果表明：野生型与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的皮肤均由表皮、真皮、皮下结缔组织3部分组成，且表皮层最薄，各毛色皮肤结构组成无差异；黑色素颗粒主要分布于黑色、棕色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织的毛囊、毛干中，且黑色较棕色皮肤组织中分布的黑色素颗粒更为密集，而在白色被毛的野生型和ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中均未发现黑色素颗粒；ASIP蛋白在白色被毛的ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的表皮、毛囊外根鞘、毛乳头周围的毛基质中大量存在，在棕色、黑色皮肤组织中几乎不存在。说明ASIP蛋白在特定部位的表达情况与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的白色被毛毛色的发生相关。     

新疆细毛羊抑制素α亚基cDNA的克隆、序列分析与表达

根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增获得了约812bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET—INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol·L^-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

平原型和田羊毛囊KAP4.2基因的克隆与原核表达

为了探索影响平原型和田羊羊毛品质的角蛋白关联蛋白(keratin association protein,KAP)4.2基因的结构与功能,试验以平原型和田羊毛囊总RNA反转录得到的cDNA为模板,经RT-PCR扩增KAP4.2基因成熟蛋白序列,与pMD18-T载体连接,经PCR扩增、双酶切鉴定连接正确后再与原核表达载体pET-28a连接,连接正确后对其测序并进行同源性分析及氨基酸分析。结果表明:平原型和田羊重组质粒pMD-18T-KAP4.2构建成功,表达质粒pET-28a-KAP4.2成功原核表达。在不同诱导时间KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,在诱导4小时时蛋白表达量最大;不同体积IPTG诱导后KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,体积为10μL时蛋白表达量最大。平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊(X05639.1)基因序列同源性为99.1%,显示有3处发生突变,分别为第77位的T突变为C,第108位的G突变为T,第200位的C突变为T。平原型和田羊KAP4.2蛋白基因第26位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸,第67位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。说明平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊基因序列同源性较高,虽然高度保守,但存在碱基突变和氨基的变异。     

猪瘟病毒Erns基因的克隆及原核表达

从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,通过R-PCR对Erns基因进行cDNA扩增,获得了696 bp的片段.将该片段克隆于T-easy载体后进行序列分析,确认PCR产物为猪瘟病毒Erns基因,从阳性克隆中提取质粒,经Bam H Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切,回收产物亚克隆到pET-32a表达载体中,提取质粒后转化BL21(DE3)感受态细胞,并筛选出阳性克隆,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测出Erns基因的表达.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因在小鼠颗粒细胞中的整合及其鉴定

为了探讨拟蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体(2S)在小鼠颗粒细胞基因组中整合和建立转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的小鼠颗粒细胞系的可能性,试验将在前期工作中人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S连接到具有CMV启动子、IRES序列和GFP报告基因的表达载体,并转染小鼠颗粒细胞。结果表明:原代培养的幼鼠卵巢的颗粒细胞在培养后的第4天达到85%汇合,继代培养1~7代时每代达到85%的汇合时间约为3 d,细胞的形态与原代培养细胞相似,呈现多角形或梭形;筛选阳性细胞的最佳G418浓度为500μg/mL;将线性化的CMV-2S-pIRES2-EGFP转染颗粒细胞,再用500μg/mLG418筛选12 d后仍有存活细胞,但是续培养细胞的增殖能力逐渐丧失;经PCR鉴定,阳性细胞扩增出目的条带。     

不同EGFP-蜘蛛丝融合基因在昆虫细胞的表达及融合丝蛋白形成机制初探

蜘蛛能吐出具有优异机械特性的多种类型的丝,其中管状腺丝用于构建卵囊并具有良好的分子和机械性能,是目前唯一报道的全长cDNA序列的蜘蛛丝。基于为将来利用生物工程方法大量生产高性能的仿蜘蛛丝纤维提供基础信息,通过Bac-to-Bac/AcNPV杆状病毒表达系统,在强启动子驱动下,对2个大小不同的蜘蛛卵囊丝蛋白基因序列(全长cDNA序列和部分cDNA序列)与EGFP报告基因实现了在AcNPV昆虫细胞中的融合表达。绿色荧光和W estern印迹分析表明,被表达出的2个大小不同的卵囊丝融合蛋白在昆虫细胞胞质中呈现出明显不同的溶解性。含有部分卵囊丝基因的短EGFP-蜘蛛丝融合基因的表达产物在胞质里具有可溶性;而含有全长卵囊丝基因的巨大EGFP-蜘蛛丝融合基因的表达产物倾向于自我装配形成沉淀聚合物。研究结果也暗示了蜘蛛丝蛋白的分子大小可能对其装配成高性能的丝纤维有重要影响。     

绵羊防御素(sBD-1)cDNA的克隆及其植物中表达载体的构建

为了获得在植物中表达的绵羊防御素 ,从绵羊舌表皮组织中分离提取总RNA ,经逆转录PCR (RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1全长cDNA ,回收扩增产物连接到克隆载体 ,测序分析表明该cDNA为 2 1 5bp ,与报道序列完全一致。将该序列替换插入质粒PBI1 2 1中的GUS编码序列 ,构建植物表达载体PBIC 35SsBD1 ,为进一步进行转基因植物和绵羊防御素功能的研究奠定了基础。     

不同羊毛纤维直径细毛羊皮肤组织差异表达蛋白质研究

试验旨在研究不同纤维直径的细毛羊皮肤组织中毛囊差异表达的蛋白质,探讨与羊毛细度相关的蛋白质功能。应用双向凝胶电泳技术建立细毛羊皮肤组织中毛囊差异表达蛋白质图谱;运用ImageMaster 2D Platinum软件检测细毛羊毛囊组织差异表达蛋白质;通过质谱鉴定技术和数据库比对等方法开展细毛羊皮肤组织毛囊特异性蛋白质分类和功能鉴定。结果成功鉴定出94个差异蛋白质,其中,相同年龄超细型细毛羊和细型细毛羊皮肤毛囊组织中有73个差异蛋白质;不同年龄的超细型细毛羊毛囊组织中有21个差异蛋白质。按功能属性划分得到了角蛋白、分子伴侣类蛋白、细胞骨架结构类蛋白、14-3-3蛋白、蛋白酶类、肌球蛋白、血清白蛋白和其他蛋白8类功能蛋白。结果提示,应用生物信息学技术分析这些差异蛋白与羊毛纤维直径的内在联系,为优质细毛羊的培育提供直接有效的基因资源信息,对提高羊毛品质具有重要的意义。     

Proteome Array on Differentially Expressed Proteins of Skin Tissue in Fine-wool Sheep with Different Fiber Diameter

The purpose of this paper was to study the differentially expressed proteins of hair follicles in skin tissue with different fiber diameter of Fine-wool sheep, and discussed the function of proteins related to wool fineness.The differentially expressed protein maps of Fine-wool sheep skin hair follicle were established by two-dimensional gel electrophoresis, and the differentially expressed protein spots were detected and analyzed by the ImageMaster 2D Platinum software, Fine-wool sheep skin hair follicle specific proteins were classified and functional identified by mass spectrum identification technology and database matching method.The results showed that 94 different proteins were successfully identified in Fine-wool sheep with different fiber diameter, including 73 different proteins between superfine wool sheep and Fine-wool sheep at the same age, and 21 different proteins of superfine wool sheep at the different age.According to the functional properties got eight kind of functional proteins, keratin, molecular chaperone protein, cytoskeleton protein, 14-3-3 protein, protease, myosin, serum albumin, other protein, respectively.These results indicated that the internal relation between the differentially expressed protein and the wool fiber diameter was analyzed by the bioinformatics knowledge, which would provide effective genetic resources information directly for high quality breeding of Fine-wool sheep, and had important practical significance for improving the quality of the wool.     

类蜘蛛丝丝素蛋白SPF198在毕赤酵母中的分泌表达

将人工合成的长度为594 bp的类蜘蛛丝丝素蛋白spf198基因克隆到表达载体pP iczαA并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Mut+(m ethanol utilization p lus)重组酵母株进行了表达。初步的研究结果显示,spf198基因在GS115酵母里可以正确表达。     

不同绵羊品种FGF5基因的多态性分析

根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5（FGFS）基因的同源序列设计引物对绵羊基因组进行PCR扩增，将扩增片段进行克隆和测序，并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较，确定扩增的片段为绵羊的FGF5基因片段。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴等4个绵羊品种的多态性。结果表明：FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性。经克隆测序分析，位于外显子1的引物1扩增产物存在G→T突变，该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变；引物2扩增产物发生了碱基序列C→T的突变，这一突变位点没有引起编码氨基酸的改变，属于同义突变。对不同绵羊品种的基因型和基因频率统计结果表明，引物1扩增产物小尾寒羊、湖羊、藏羊以等位基因A为主，而中国美利奴羊则以等位基因B为主，且各群体均处于Hardy-Weinberg平衡；引物2扩增产物小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊均以等位基因E为主，而藏羊的基因型频率与其它品种有显著差异，中国美利奴羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态。     

基于单细胞转录组测序技术对鄂尔多斯细毛羊次级毛囊形态发生诱导期的研究

【目的】试验旨在解析鄂尔多斯细毛羊胚胎期次级毛囊诱导期形态发生过程中主要细胞类型的分子特征和分化过程。【方法】对采集的3只鄂尔多斯细毛羊(胎龄87 d)体侧部(肩胛骨后缘处)的皮肤样本进行HE染色,鉴定毛囊的发育时期;部分皮肤样本经过混样后进行单细胞转录组测序(scRNA-Seq),应用t-分布随机近邻嵌入(tSNE)分析细胞簇,分别使用胶原Ⅰ型α1链(Col1a1)和角蛋白15(Krt15)鉴定真皮谱系细胞和表皮谱系细胞,并使用皮肤组织不同细胞的标记基因进行细胞类型分析;对测序数据进行拟时序分析,探究其分化过程中差异基因的表达;通过GO功能富集分析进一步验证基因的功能。【结果】HE染色结果发现,鄂尔多斯细毛羊在胎龄87 d处于次级毛囊诱导期。通过scRNA-Seq在胎龄87 d的细毛羊体侧部皮肤细胞样品中获得10 603个细胞和18 704个基因的scRNA-Seq数据可用于下游分析。tSNE分析发现,皮肤组织中共有15个细胞簇;Col1a1和Krt15标记基因鉴定表明,真皮细胞和表皮细胞具有高度异质性。拟时序分析构建毛囊形态发生过程中真皮/表皮细胞谱系细胞的分化轨迹和基因动态表达图...     

绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9基因的扩增及表达

本试验旨在构建绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(keratin type Ⅱ intermediate filament 9,KIF Ⅱ-9)基因cDNA的毛囊特异性表达载体,转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达外源基因并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过PCR扩增得到的KAP6-1基因启动子,然后与RT-PCR扩增得到的KIFⅡ-9 cDNA 序列连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,将重组表达载体以脂质体介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因细胞克隆,结果显示,外源KAP6-1启动子序列和KIF Ⅱ-9 cDNA整合到细胞基因组中,为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊提供了条件。     

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2（keratin-associated protein 2,KAP2）基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463 bp的KAP2基因,开放阅读框架（ORF）长414 bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸（Arg）变为谷氨酰胺（Gln）,属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84 ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。