阿维链霉菌aveC基因缺失对产素调控的影响

通过构建仅含有aveC基因两端交换臂的缺失载体,与阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体中aveC基因发生同源重组,以阻断该基因,从而获得aveC缺失突变株。并经摇瓶发酵和高效液相色谱检测不同阿维菌素组分产量。结果显示,aveC缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量差异不显著;而阿维菌素组分1的产量下降约58%,组分2的产量提高约52%。     

透明颤菌血红蛋白基因在吸水链霉菌NND-52-C中的克隆与表达

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)克隆至链霉菌的质粒载体pIJ702中，构建成表达载体pLY702，并将pLY702质粒转化阿扎霉素B的高产菌株——吸水链霉菌NND—52—C的原生质体，获得转化子H。经发酵实验表明，在限氧的条件下，可以使NND—52—C菌株的生物量提高14．4％，阿扎霉素B的产量提高30．8％。     

阿维菌素高产菌的育种研究进展

阿维菌素是阿维链霉菌产生的具有杀虫活性的大环内酯类抗生素,在农业和畜牧业中应用广泛。对近年来的研究概况,从产特定组分阿维茵素菌种选育、阿维菌素高产菌选育和阿维菌素的改造创新等方面进行了综述。     

阿维菌素B1a组分高产菌株的高通量选育

为筛选阿维菌素高产菌株,建立了阿维菌素高产菌株的高通量初筛及复合诱变技术选育高产菌株的方法。初筛首先采用24孔板培养突变株,发酵培养5 d,甲醇直接浸提固体培养物,最后利用96孔板-酶标仪检测浸提液在紫外波段245 nm吸收。以阿维链霉菌(Streptromyces avermitilis)编号为AV-X-95的阿维菌素产生菌作为出发菌株,通过紫外线(UV)照射45 s和亚硝基胍(NTG)处理60 min的组合诱变方法对出发菌株的孢子悬液进行了连续的诱变处理。研究结果表明,1 728株突变子的经高通量初筛后得到8株高产菌株,经摇瓶复筛和稳定性考察得到高产菌株AW4-329,其B1a产量较出发菌株提高了15.1%。     

阿维菌素Bla组分高产菌株的高通量选育

为筛选阿维菌素高产菌株,建立了阿维菌素高产菌株的高通量初筛及复合诱变技术选育高产菌株的方法.初筛首先采用24孔板培养突变株,发酵培养5 d,甲醇直接浸提固体培养物,最后利用96孔板-酶标仪检测浸提液在紫外波段245 nm吸收.以阿维链霉菌(Streptromyces avermitilis)编号为AV-X-95的阿维菌素产生菌作为出发菌株,通过紫外线(UV)照射45 s和亚硝基胍(NTG)处理60min的组合诱变方法对出发菌株的孢子悬液进行了连续的诱变处理.研究结果表明,1 728株突变子的经高通量初筛后得到8株高产菌株,经摇瓶复筛和稳定性考察得到高产菌株AW4-329,其Bla产量较出发菌株提高了15.1%.     

阿维菌素生产菌的复合诱变

为筛选阿维菌素高产菌株,提高阿维链霉菌的发酵单位,降低生产成本,本试验主要采用紫外诱变结合不同类型抗生素的双重筛选方法对出发菌株AW-8进行诱变选育.结果表明:共筛选出具有链霉素单抗高产菌株16株,正突变率为10.7％;筛选出具有利福平单抗高产菌株27株,正突变率为14.2％;筛选出具有链霉素和利福平双抗高产菌株6株,...     

过表达根瘤血红蛋白基因对活跃链霉菌那西肽产量的影响

[目的]采用过表达根瘤血红蛋白基因改善活跃链霉菌的溶氧表达,以提高那西肽的产量。[方法]通过全基因组合成的方法得到根瘤菌血红蛋白基因(sm),连接到整合型质粒p IB139上,构建表达载体p IB139-sm。通过大肠杆菌-链霉菌结合转移的方法将sm基因整合到活跃链霉菌基因组上,通过PCR验证各转化子目的片段已整合到活跃链霉菌基因组上,并进行大量筛选得到重组菌株。[结果]经SDS-PAGE和CO结合差示光谱分析,结果显示,目的蛋白均已成功表达且具有相应的蛋白活性。摇瓶培养结果显示,Smf Hb表达对菌体生长和那西肽产量有明显的促进作用,过表达Smf Hb的重组菌株那西肽产量达1 245.7μg/m L,比原始菌株提高39.6%。[结论]过表达sm基因提高那西肽产量的作用优于vhb。     

强启动子A4促进黄色链霉菌高产放线菌素D

【背景】放线菌素D是神经母细胞瘤、绒毛膜上皮癌和横纹肌肉瘤等恶性肿瘤的特效药,黄色链霉菌TRM 45540是一株产放线菌素D的高产菌株。【目的】通过导入强启动子A4,以期提高黄色链霉菌合成放线菌素D的产量。【方法】将强启动子A4整合到质粒pSET152中,转化到大肠杆菌,通过大肠杆菌与黄色链霉菌TRM 45540的接合转移,将启动子A4片段插入黄色链霉菌中,采用高效液相色谱法对接合子TRM 45540::pYS001和野生菌株TRM 45540进行发酵产物中放线菌素D的比较分析。【结果】启动子A4片段成功插入到黄色链霉菌TRM 45540::pYS001,与原始菌株相比,在相同发酵条件下放线菌素D的产量提高了26. 85%,产量达821. 8 mg/L。【结论】强启动子A4能够促进黄色链霉菌高产放线菌素D。     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

Co60γ射线照射技术在阿维菌素产生菌诱变育种中的应用

为了筛选获得阿维菌素总效价及有效组分Bla含量高的阿维链霉菌突变株,应用Co60γ射线照射并结合甲硫氨酸筛选模型和5-氟尿嘧啶筛选模型对出发菌株阿维链霉菌H20-16进行诱变处理,使用高效液相色谱法检测发酵单位与有效组分B1a的含量.通过筛选获得发酵单位提高的菌株Co3-15和CF(20)-39-61,比出发菌株分别提高了173.3%、76.5%;Bla组分提高的菌株Co35-9和CM35-12,比出发菌株分别提高了12.1%、16.7%.从而得出,利用Co60γ射线照射并结合甲硫氨酸和5-氟尿嘧啶筛选模型诱变处理阿维菌素产生菌,诱变效果显著.     

培养基成分和补料对阿维菌素发酵过程中除虫链霉菌菌丝形态的影响

研究了阿维菌素发酵过程中培养基成分和补料对菌丝形态的影响,以及在这些条件下菌丝形态、菌体代谢以及产量之间的相互关系。结果表明:碳氮源种类和碳氮比与菌体生长密切相关,对除虫链霉菌前期的菌丝形态影响较大。只有当除虫链霉菌为密实的球状时,才能获得较高的阿维菌素产量;进一步通过调控使发酵中后期菌丝形态保持一定的菌球尺寸(球核面积、核区周长和菌丝球面积)对维持阿维菌素合成有利。     

重离子辐照阿维菌素产生菌的诱变选育

应用不同剂量12C+6重离子束对出发菌株ZJAV-A1进行辐照选育,并应用高效液相色谱法测定发酵液中有效组分B1a的含量.结果表明:当重离子束12C+6离子的辐照剂量为50Gy时,B1a含量的延变率最高,为34.2%;诱变后的菌落共培养出4种菌型,即草帽型、馒头型、光秃型和皱缩型,其中,草帽型高产菌株ZJAV-Y203的发酵液中B1a组分比出发菌株提高了51.43%.说明利用12C+6重离子束辐照处理阿维菌素产生菌,可以得到高产B1a组分的诱变菌株,其诱变效果显著.     

利用Minitab软件优化阿维菌素产生菌发酵培养基

利用Minitab软件中的响应面设计法,对1株产高纯度阿维菌素B组分的阿维链霉菌菌株发酵培养基进行优化。首先利用Plackett-Burman设计研究原始培养基各成分对响应值的影响程度,结果表明:玉米淀粉、黄豆饼粉、CoCl2.6H2O三因素对阿维菌素B1a组分产量影响显著,进一步利用Box-Behnken分析方法确定了其最佳质量浓度。优化后的发酵培养基为(g/L):玉米淀粉92.19,花生饼粉10,黄豆饼粉9.70,酵母粉5,酵母浸膏2.8,玉米浆2.2,CoCl2.6H2O 0.04。采用优化后的培养基,其发酵液阿维菌素B1a产量达到525μg/mL,比优化前提高了45%。     

阿维链霉菌aveD基因的定点突变(英文)

[目的]获得aveD基因定点突变株,为阿维菌素的遗传育种提供理论依据。[方法]采用重叠延伸PCR技术对aveD基因进行定点突变,并通过体外酶切连接等分子生物学操作,构建了aveD基因的定点突变载体pDC3(pKC1139∷aveD、),导入阿维菌素(Avermectin)产生菌阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因缺失突变株489中。[结果]经过同源重组,获得aveD基因定点缺失突变株536。测序结果表明突变株536,aveD基因编码区中第69位碱基C突变为T,相应的氨基酸序列第23位由Thr突变为Ile。[结论]该研究为研制生产阿维菌素B的基因工程菌奠定了基础。     

谷氨酸棒状杆菌gdh基因在黄色短杆菌C-11中的克隆及表达

[目的]研究谷氨酸脱氢酶的表达对L-丝氨酸产率及发酵效率的影响.[方法]从谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicum ATCC39135中克隆出gdh基因,以大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7为基础,构建重组质粒pEC7G,并转化黄色短杆菌B.flavum C -11,获得重组菌株C-11G.[结果]重组菌株C-11G的GDH酶活力提高32.7;,产酸率为15.28 g/L,比原宿主菌提高了33.80;.[结论]成功构建重组菌株C-11G,所克隆的gdh基因有较高表达活性,并对L-丝氨酸产量的提高有促进作用.     

巴氏芽孢八叠球菌诱变选育脲酶高产菌株

脲酶催化尿素的水解生成形成铵根离子和碳酸根离子,具有广泛的应用价值。以巴氏芽孢八叠球菌ATCC11859为出发菌株, 通过亚硝基胍诱变,得到高产脲酶突变株。其中菌株B\|20的脲酶活性最高,为28.4 mmol/min,较出发菌株提高了207%。对该菌株接种量、氮源种类培养条件进行优化,结果表明接种量为10%,且采用大豆粉为氮源时,脲酶活性最高为32.9 mmol/min。对脲酶高产菌株的选育表明该方法是一种行之有效的方法。     

A previously unknown maltose transporter essential for starch degradation in leaves

A previously unknown maltose transporter is essential for the conversion of starch to sucrose in Arabidopsis leaves at night. The transporter was identified by isolating two allelic mutants with high starch levels and very high maltose, an intermediate of starch breakdown. The mutations affect a gene of previously unknown function, MEX1. We show that MEX1is a maltose transporter that is unrelated to other sugar transporters. The severe mex1 phenotype demonstrates that MEX1is the predominant route of carbohydrate export from chloroplasts at night. Homologous genes in plants including rice and potato indicate that maltose export is of widespread significance.     

银杏木质部特异定位表达基因启动子克隆

用PCR方法成功地从木本植物银杏基因组总DNA中扩增克隆得到木质部细胞特异性表达的富甘氨酸蛋白质基因 (GRP1.8)的启动子 ,并克隆到pUC18载体中 .与菜豆的序列比较发现 ,碱基同源性高达 98%以上 .除发现启动子特有的TATAbox序列外 ,还发现在菜豆序列中所没有的GATAG碱基序列