直接提取病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎试验

为研究奶牛隐性乳房炎主要致病菌的快速检测方法,本试验选取山西省太原市小店区某规模化奶牛场39头隐性乳房炎患牛,利用Chelex-100方法直接提取奶样金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及停乳链球菌DNA进行检测。结果表明,利用Chelex-100方法直接提取奶样中病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎,具有简单、快速、经济、无污染、PCR敏感性高等优点,对PCR快速检测奶牛隐性乳房炎具有重要意义。     

奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。     

牛乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的PCR检测应用研究

采集92份患隐性乳房炎牛的乳汁,分别用PCR法和常规法进行致病菌检测,常规细菌鉴定法检测出金黄色葡萄球菌感染样18份,无乳链球菌感染样30份;双重PCR检测出金黄色葡萄球菌感染样22份、无乳链球菌感染样27份。本试验从基因水平对致病性乳汁进行检测,具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强等特点。     

黑龙江省某奶牛场奶牛乳房炎主要致病菌鉴定及药敏试验

黑龙江省某奶牛场奶牛乳房炎发病率高,牛乳中体细胞超标严重,严重影响该奶牛场的经济效益。为了明确引起该奶牛场奶牛乳房炎的主要致病病原菌,筛选敏感药物给出治疗方案。本实验对该奶牛场中30份奶牛乳房炎乳汁进行乳样处理、细菌培养、药敏试验及DNA提取和PCR扩增。通过DNA提取和PCR扩增确定其主要致病病原菌大多为无乳链球菌、停乳链球菌、肠球菌及少量金黄色葡萄球菌。乳样中并未检测出支原体、乳房链球菌及变形杆菌。药敏试验结果表明,该场患病奶牛对阿莫西林、头孢噻呋钠敏感,对一种商品名为惠可宁的硫酸头孢喹肟乳房注入剂耐药性明显。最终得出该厂患乳房炎奶牛的乳汁中分离出的细菌大多数为停乳链球菌,无乳链球菌,肠球菌和少量的金黄色葡萄球菌。当本地区奶牛检测为乳房炎时,可首选阿莫西林,头孢噻呋钠等敏感药物治疗,对奶牛乳房炎的治疗具有积极的指导意义。     

乳房炎3种病原菌DNA提取方法比较研究

旨在比较3种DNA提取方法对山羊乳中致乳房炎主要病原菌DNA的提取效果及对PCR检测的影响。将不同浓度的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠埃希氏菌加入羊乳中,并分别用硅胶膜试剂盒、酚/氯仿法和CTAB/NaCl法等3种方法提取总DNA,比较所获得DNA的浓度、纯度、所需时间和经济成本及对各病原特异性PCR检测的影响。结果显示,各方法均能成功地提取羊乳中致乳房炎的3种病原菌DNA;硅胶膜试剂盒和CTAB/NaCl法提取山羊乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌DNA的效果相同且明显优于酚/氯仿法;3种方法提取山羊乳中大肠埃希氏菌的效果相同。CTAB/NaCl法具有提取效果好、耗时较短、成本低和方便的优点,是从羊乳中提取病原DNA的良好方法。研究结果为临床上山羊乳房炎病原菌的分子检测和流行病学调查提供了方法学上的参考。     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

参照GenBank发表的序列，在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染l临床标本。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为10^4CFU／mL，检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为10^4CFU／mL、10^3CFU／mL和10^3CFU／mL。通过对采自临床型乳腺炎（46个）和隐性乳腺炎（167个）动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率（P〈0．01），但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著（P〉0．05）。     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

噬菌体内溶素对奶牛乳房炎致病菌的溶解作用

奶牛乳房炎一直是困扰养牛业的顽疾。诱发奶牛乳房炎的致病菌通常包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等致病菌,停乳链球菌、乳房链球菌、大肠埃希菌等环境致病菌以及表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌等机会性致病菌。噬菌体是一类细菌依赖性的病毒,可通过内溶素抑制肽聚糖的合成,或利用穿孔素-内溶素系统水解肽聚糖。在体外试验中,噬菌体及其内溶素可溶解、抑制细菌生物膜,裂解乳房炎致病菌;在体内试验中,可清除感染动物体内的乳房炎致病菌,对奶牛乳房炎具有治疗效果。因此,噬菌体及其内溶素在奶牛乳房炎治疗方面具有良好的应用前景。     

奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man荧光PCR检测方法的建立

为同时检测大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌,提高对奶牛乳房炎的诊断率,本试验针对3种病原菌的保守序列设计合成了3套特异性引物,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法。结果显示,该检测方法具有高特异性,与肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌等无交叉反应;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的最低检测浓度分别为10~(3 )、10~2和10~(4 )拷贝数/μL,敏感度较高。DNA各个拷贝数浓度的变异系数均低于2.02%,表明重复性良好。对24份临床采集奶样的检测结果表明,建立的多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法可用于临床大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测,具有良好的推广应用价值。     

环介导等温扩增法检测牛奶中结核分枝杆菌条件的优化

为优化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法检测牛奶中结核分枝杆菌的条件,以结核分枝杆菌高度保守的16S rRNA基因为靶基因设计3对特异性引物（F3-B3、FIP-BIP、FLP-BLP）进行试验。比较改良后的CATB/NaCl法、细菌基因组DNA提取试剂盒及热裂解法提取其DNA的效率,确定最佳的提取方法。用灭菌处理过的牛奶对结核分枝杆菌悬液进行倍比稀释以确定该检测方法的敏感度。以牛奶中常见的布鲁氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为对照,对该方法进行特异性测试。结果表明,改良后的CTAB/NaCl法对牛奶中结核分枝杆菌DNA的提取效果要优于其他两种方法。LAMP法检测结核分枝杆菌的灵敏度为3×10⁰ CFU/mL,对人工阳性乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度为3×10¹ CFU/mL。     

Study on Optimization of the Conditions of Detecting Mycobacterium tuberculosis in Milk by Technique of Loop-mediated Isothermal Amplification

To optimize the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method to detect Mycobacterium tuberculosis in milk,the highly conservative 16S rRNA gene of Mycobacterium tuberculosis was selected as a target to design specific primers.Compared the modified method of CATB/NaCl,bacterial genome DNA extraction kit and thermal cracking method to extract the DNA of Mycobacterium tuberculosis,the best approach was chosen.Mycobacterium tuberculosis suspension liquid was diluted with sterilization milk to confirm the susceptibility of this assay.And then Brucella,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Listeria monocytogenes,Bacillus pasteurii and Salmonella were used for specificity detection.The results showed that the modified method of CATB/NaCl was better than the others.The sensitivity of LAMP was 3×10⁰ CFU/mL,and the specificity was 100%.The sensitivity of detecting Mycobacterium tuberculosis in milk by LAMP was 3×10¹ CFU/mL.     

Rapid identification of bovine mastitis pathogens by high-resolution melt analysis of 16S rDNA sequences

Accurate identification of mastitis pathogens is often compromised when using conventional culture-based methods. Here, we report a novel, rapid assay tested for speciation of bacterial mastitis pathogens using high-resolution melt analysis (HRMA) of 16S rDNA sequences. Real-time PCR amplification of 16S rRNA gene fragment, spanning the variable region V5 and V6 was performed with a resulting amplicon of 290bp. First, a library was generated of melt curves of 9 common pathogens that are implicated in bovine mastitis. Six of the isolates, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus and Mycoplasma bovis, were type strains while the other 3, Arcanobacterium pyogenes, Corynebacterium bovis and Streptococcus dysgalactiae, were bovine mastitis field isolates. Four of the type strains, E. coli, S. agalactiae, K. pneumoniae and S. aureus, were found to be of human origin, while the other 3 type strains were isolated from bovine infections. Secondly, the melt curves and corresponding amplicon sequences of A. pyogenes, E. coli, S. agalactiae, S. dysgalactiae, K. pneumoniae, S. uberis and S. aureus were compared with 10 bovine mastitis field isolates of each pathogen. Based on the distinct differences in melt curves and sequences between human and bovine isolates of E. coli and K. pneumoniae, it was deemed necessary to select a set of bovine strains for these pathogens to be used as reference strains in the HRMA. Next, the HRMA was validated by three interpreters analyzing the differential clustering pattern of melt curves of 60 bacterial cultures obtained from mastitis milk samples. The three test interpreters were blinded to the culture and sequencing results of the isolates. Overall accuracy of the validation assay was 95% as there was difficulty in identifying the streptococci due to heterogeneity observed in the PCR amplicons of S. uberis. The present study revealed that broad-range real-time PCR with HRMA can be used as a powerful, fast and low-cost tool for the differentiation of clinically important bacterial mastitis pathogens.     

荧光定量PCR检测牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立

为建立检测牛乳中金黄色葡萄球菌(S.aureus)肠毒素A基因(SEA)定性定量的检测方法,本研究针对S.aureus SEA基因片段设计1对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为78.2℃～78.5℃,最低可检测到49.5 fg/μL(16.5拷贝)的阳性质粒.标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见的产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5 α及JM109均无交叉反应.该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为牛乳中S.aureus的快速检测提供了新的技术手段.     

大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6（IL-6）、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）;金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10⁵、1×10⁶ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量极显著高于空白对照组（P<0.01）,感染浓度为1×10⁷ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,感染浓度为1×10⁶ CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,其他感染浓度均与空白对照组无显著差异（P>0.05）。奶牛子宫内膜组织感染1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组（P<0.01）。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。     

Incidence of clinical mastitis on farms with low somatic cell counts in bulk milk

A total of 1140 clinical cases of mastitis, with at least one inflamed quarter, were reported on 125 farms with somatic cell counts in bulk milk less than 150,000/ml. The average annual incidence was 17.9 cases per 100 cows and ranged from none to 80 cases per 100 cows. The microorganisms most frequently isolated were Escherichia coli (16.2 per cent), coagulase negative staphylococci (13.0 per cent), Staphylococcus aureus (9.6 per cent) and Streptococcus uberis (8.0 per cent). Only two cases of Streptococcus agalactiae were found. As the incidence of clinical mastitis increased, the proportion of S aureus also increased, while the proportions of E coli, S uberis and Streptococcus dysgalactiae remained about the same. Most of the clinical cases of mastitis occurred in early lactation, in November, December and January. However, after correction for the number of calvings per month, the incidence of mastitis was highest in the early summer months.     

"乳康2号"对奶牛细菌性乳房炎的疗效研究

用＂乳康2号＂治疗临床型乳房炎奶牛37头。结果表明,治愈28头,有效6头,无效3头,总有效率为91.89%,平均治疗时间4.7d。对采集的37头奶牛治疗前的42个乳区奶样,进行细菌学检查,有33个乳区检出与乳房炎有关的病原菌,占78.57%。检出病原菌5种,主要为无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌和大肠埃希菌。停药后采集33个乳区奶样,结果有14个乳区细菌转阴,细菌转阴率为42.42%。在转阴的病原菌中,大肠埃希菌转阴率最高（100%）,其次是混合感染（60.00%）和乳房链球菌（50.00%）。     

辽宁地区奶牛乳房炎细菌性病原分离鉴定及大肠杆菌药敏试验

为了掌握辽宁地区奶牛乳房炎主要细菌性病原种类及致奶牛乳房炎大肠杆菌药物敏感性特征,本研究选取辽宁地区某大型奶牛场75头临床表现为乳房炎的奶样进行细菌培养与分离,通过生化方法对分离到的细菌进行鉴定,并对分离到的奶牛源大肠杆菌进行体外药物敏感性试验研究。结果发现,该场奶牛乳房炎细菌性病原主要为大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌,其检出率分别为58.7%、64.0%和54.7%,存在二重感染和三重感染等混合感染的情况。大肠杆菌药物敏感性试验结果表明,该场分离株对磺胺类药物（耐药率>85%）及氯霉素类药物（耐药率>30%）耐药性较高,对氨苄西林（9.5%）、环丙沙星（9.5%）、头孢噻呋（7.1%）和氧氟沙星（4.8%）比较敏感。上述研究结果为该地区奶牛乳房炎的防制提供可靠的理论依据。