猪葡萄球菌437-2株的分离鉴定及生物学特性

从发生渗出性皮炎的仔猪体内分离到1株细菌,根据其形态特征和生化特性,结合16S rRNA核苷酸序列分析,确定为猪葡萄球菌,并命名为437-2株.用1×109 CFU/mL剂量的该菌株经皮下感染小鼠、仔猪,均能引起注射部位皮肤脱毛、破渍、有炎性渗出物、结痂等病变,病理学观察可见表皮局部上皮细胞消失、皮下小血管充血和炎症细...     

猪葡萄球菌脱落毒素多重PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank已发表的猪葡萄球菌的6种脱落毒素基因序列,设计合成了6对相应的特异性引物,通过特异性、敏感性和重复性试验建立了可行的多重PCR检测方法。用该方法对临床分离到的9株猪葡萄球菌进行检测,均扩增出了与预期大小相符的23SrDNA（662bp）条带;同时,其中6株分别扩增出了EXHA（316bp,2株）、EXHC（525bp,2株）和Shet-A（814bp,2株）基因特异性条带;另外3株均未扩增出任何毒素基因特异性条带,鉴定为无毒力菌株,以上结果与生化鉴定及单一PCR检测测序结果一致。结果表明,本试验所建立的多重PCR方法不仅操作快速方便、节约试验成本,而且具有高度特异性、敏感性和良好的重复性,可用于仔猪渗出性皮炎的诊断和猪葡萄球菌的快速鉴定。     

猪葡萄球菌临床分离株感染仔猪渗出性皮炎模型的建立

为建立研究仔猪渗出性皮炎发病机制及治疗制剂的动物模型,本研究采用PCR及BLAST序列比对方法对猪葡萄球菌437-2株毒素基因型进行鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过不同浓度菌液人工感染仔猪试验分析该菌株的临床致病力、最小致病浓度、发病周期及组织病理学变化。结果显示,该分离菌株为ExhD毒素基因型,其毒素基因与德国分离株（GenBank登录号：AM94662.1）和俄罗斯分离株（GenBank登录号：AM950188.1）的ExhD基因同源性达99%;药敏试验结果显示,该菌株为多重耐药菌株,对青霉素、磺胺异噁唑、链霉素、阿奇霉素、红霉素、四环素、杆菌肽及诺氟沙星耐药;仔猪致病性试验结果显示,低剂量组在整个试验周期内仅注射部位表现出皮炎症状,而中、高剂量组在耳后皮下注射2 d后均出现显著的渗出性皮炎症状,病猪表现为耳后出现油皮,全身被毛粗糙,皮肤呈深褐色厚皮痂,有大片蜕皮和黄色液体渗出;感染仔猪的脏器和皮肤病理切片结果显示,低剂量组仔猪脏器无异常,耳部皮肤角质层角化过度,炎性细胞浸润,无棘皮层细胞分离,而中、高剂量组感染仔猪脏器具有一定程度的损伤,皮肤表皮棘细胞层出现明显的细胞分离。上述试验结果说明,利用猪葡萄球菌437-2株可成功建立仔猪渗出性皮炎模型,所需的最小攻菌浓度为1×10⁹ CFU/mL。     

猪渗出性皮炎病原的分离鉴定

从疑似渗出性皮炎的哺乳仔猪体内分离到一株细菌,经革兰染色镜检以及TH-16S细菌生化鉴定系统和葡萄球菌16S rRNA、gap基因通用引物鉴定.结果表明,该菌株为葡萄球菌,gap基因的核苷酸同源性为99%.动物试验发现,试验小鼠出现躁动、被毛竖立、精神沉郁,18 h死亡,说明该菌株对小鼠具有致病力.     

猪细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因长度为1986 bp,共编码659个氨基酸,其中NS1基因的1287、1288和1298位碱基发生了缺失,导致429、430和433位氨基酸发生缺失。系统发生树结果表明,本试验测序的NS1基因与NADL-2弱毒株处在同一进化分支;氨基酸同源性与NADL-2弱毒株和Kresse毒株最高,均为98.6%。蛋白质结构预测分析结果表明,非结构蛋白NS1的分子质量为75269.76 u,理论等电点pI为7.25,不稳定系数为41.57,推测其为不稳定蛋白质;脂肪指数为73.58,总体平均亲水性为-0.565,推测该蛋白质是一种亲水性蛋白质;该蛋白质含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈连续分布;非结构蛋白NS1无跨膜区和信号肽;预测非结构蛋白NS1含有3个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、22个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点及1个ATP/GTP结合位点基序A(P-环);该蛋白质抗原表位较多,存在10个主要的抗原表位。     

猪葡萄球菌脱落毒素研究进展

猪渗出性皮炎是一种由猪葡萄球菌引起的哺乳或断奶仔猪的急性传染病.猪葡萄球菌产生的脱落毒素被认为是引起猪渗出性皮炎的主要因子之一,不同毒株可以产生不同的毒素,分别被命名为ExhA、ExhB、ExhC和ExhD 4种.论文就近年来对猪葡萄球菌脱落毒素的结构特征、生物学功能以及在诊断和免疫学方面的研究进行综述.     

猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测

本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9).基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肤序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切.     

1株猪葡萄球菌强毒株的分离鉴定及致病性试验

为确定广东省增城某猪场产房仔猪暴发渗出性皮炎的致病菌,从病猪心脏、肺脏、病变皮肤分离并纯化细菌,经形态学观察,镜检,生化特性及gap基因的序列分析,确定为猪葡萄球菌,命名为ZC-4株。药敏试验结果显示该菌株对头孢拉定、头孢唑啉、新生霉素高度敏感,对头孢噻肟、万古霉素、庆大霉素中度敏感,对青霉素、阿莫西林、磺胺类药物、链霉素、恩诺沙星等均耐药。对分离株毒素基因进行检测,结果显示,分离株携带ExhA毒素基因,测序结果表明,其编码区全长为822bp,编码274个氨基酸;氨基酸序列与丹麦分离株ExhA基因(AF515453)的同源性最高,为99.6%;遗传进化分析显示,分离株所携带的毒素基因与参考菌株猪葡萄球菌ExhA毒素基因聚类紧密,位于一个小的分支内。分离株致病性试验结果显示,分离株接种25日龄健康断奶仔猪后24h,病猪耳根、四肢内侧、背部、腹部、臀部、尾根等部位出现蜕皮并露出有液体渗出的鲜红创面,继而皮肤形成一层厚厚的结痂,说明该菌株具有较强的致病性。本试验为猪葡萄球菌疫苗的研制及致病机制研究提供了理论依据。     

犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用,试验根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因。结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144个氨基酸;生物软件分析结果表明,该序列与猕猴的亲源性更近,与已知人、马、牛、野猪、豹猫、鸡等序列的同源性较低。     

犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用,试验根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因.结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144...     

Studies on the Virulence of Staphylococcus hyicus

Abstract— Culture supernatants from six Staphylococcus hyicus isolates were concentrated by ultrafiltration and were injected intradermally into the abdominal skin of 2-week-old piglets. Two distinct types of reaction were observed; (1) a focal erythema and (2) an exfoliative reaction with crusting. The severity of these reactions and the number of animals affected differed between isolates. The exfoliative reaction observed in these skin tests may be a good indicator of virulence. Résumé— Les surnageants de six souches de Staphylococcus hyicus ont été concentrés par ultrafiltration et furent injectés par voie intradermique dans la peau de l'abdomen de porcelets ägés de deux semaines. Deux types distincts de réactions furent observés: (1) un éryhème focal et (2) une réaction d'exfoliation avec apparition de croûtes. L'intensité de ces réactions et le nombre d'animaux atteints différaient selon les souches. La réaction d'exfoliation observée lors de ces tests pourrait être un bon indicateur de virulence. Zusammenfassung— Überstände der Kultur von sechs Staphylococcus hyicus-Isolaten wurden durch Ultra-zentrifugieren konzentriert und bei 2 Wochen alten Ferkeln intradermal in die Abdominalhaut injiziert. Es konnten zwei deutlich unterscheidbare Reaktionen beobachtet werden: (1) ein fokales Erythem und (2) eine exfoliative Reaktion mit Krustenbildung. Die Schwere dieser Reaktionen und die Zahl der betroffenen Tiere war je nach Isolat unterscheidlich. Die exfoliative Reaktion bei diesen Hauttests könnte ein guter Indikator für die Virulenz sein. Resumen Los sobrenadantes de 6 cultivos diferentes de Staphylococcus hyicus se concentraron mediante ultrafiltración y se inyectaron via intradérmica en la piel abdominal de lechones de dos semanas de edad. Se observaron dos tipos de reacción: (1) un eritem focal y (2) una reacción exfoliativa y costrosa. La gravedad de las reacciones y el nümero de animales afectados variaba en functión del cultivo utilizado. La reacción exfoliativa que se observó en estos tests intradérmicos puede ser un buen indicador de virulencia.     

Interaction of Staphylococcus hyicus and an inhibitor producing strain of Staphylococcus chromogenes on the skin of gnotobiotic piglets

Abstract— The effects of an inhibitor-producing strain of Staphylococcus chromogenes on the colonisation and disease produced by virulent and avirulent strains of Staphylococcus hyicus were examined. In the presence of S. chromogenes the colonisation of the virulent strain was reduced one thousand fold and the onset of lesions was delayed by 7 days. The ability of the avirulent strain of S. hyicus to colonise skin was greatly reduced and populations became almost undetectable within 6 days of inoculation. Résumeé— Les effets d'une souche de Staphylococcus chromogenes, productrice d'un facteur d'inhibition, ont été examinés sur la colonisation et la maladie produites par des souches non virulentes et virulentes de Staphylococcus hyicus. En présence de S. chromogenes, la colonisation de la souche virulente a été réduite de 1000 fois, et l'apparition des lésions a été retardée de 7 jours. La faculté pour la souche non virulente de S. hyicus de coloniser la peau a été considérablement réduite et les populations sont devenues à peu près introuvables 6 jours après l'inoculation. Zusammenfassung— Die Wirkungen Inhibitor-produzierenden Art von Staphylococcus chromogenes auf die Kolonisierung und Erkrankung der Haut durch virulente und avirulente Arten von Staphylococcus hyicus wurden untersucht. In Gegenwart von S. chromogenes wurde die Kolonisierung der virulenten Art um den Faktor 1000 verringert und des Auftreten der Hautveränderungen um 7 Tage verzögert. Die Fähigkeit zur Kolonisierung der Haut durch die avirulente 5. hyicus-Art wurde sehr stark verringert, ihre Population konnte innerhalb von 6 Tagen nach Inokulation nicht mehr nachgewiesen werden. Resumen Se estudian los efectos de una cepa de Staphylococcus chromogenes productora de un inhibidor sobre la colonización y la enfermedad producida por cepas virulentas y avirulentas de Staphylococcus hyicus. En presencia de S. chromogenes la colonización de cepas virulentas se redujo a una milésima parte y la aparición de lesiones se retrasó 7 días. La capacidad de cepas avirulentas de S. hyicus para colonizar la piel se vió fuertemente reducida y las poblaciones bacterianas eran prácticamente no detectables a los 6 días de la inoculación.     

Distribution of the putative virulence factor encoding gene sheta in Staphylococcus hyicus strains of various origins

In the present study, Staphylococcus (S.) hyicus strains isolated in Russia (n = 23) and Germany (n = 17) were investigated for the prevalence of the previously described genes sheta and shetb. Sheta was detected in 16 S. hyicus strains. Sheta-positive strains were mainly found among strains isolated from exudative epidermitis, and frequently together with the exfoliative toxin-encoding genes exhD and exhC. Partial sequencing of sheta in a single S. hyicus strain revealed an almost complete match with the sheta sequence obtained from GenBank. None of the S. hyicus strains displayed a positive reaction with the shetb-specific oligonucleotide primer used in the present study. According to the present results, the exotoxin encoding gene sheta seems to be distributed among S. hyicus strains in Russia and Germany. The toxigenic potential of this exotoxin, which does not have the classical structure of a staphylococcal exfoliative toxin, remains to be elucidated.     

一株乳源松鼠葡萄球菌ExhC基因的克隆及序列分析

松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri,S.sciuri)是引起奶牛乳房炎(Cow Mastitis)的病原菌之一,其主要致病因子是该菌产生的脱皮毒素C(Exfoliative Toxin C,ExhC)。为了深入了解该基因的分子特征,本试验对从乳房炎患牛牛乳中分离的一株松鼠葡萄球菌ExhC基因(Genbank登录号:MT845354)进行了克隆及序列分析。按GenBank收录的ExhC基因设计并合成引物,利用PCR对ExhC基因进行扩增,并对扩增后的ExhC基因进行测序及分析。结果表明,松鼠葡萄球菌ExhC基因的开放阅读框序列长度为837bp,共编码278个氨基酸。通过Blast模块对ExhC基因进行同源性分析,得到5株相似序列,与ExhC基因序列相比同源性均为99.04%。系统进化树图指示该基因与其余五株相似序列属于不同的分支,遗传距离较远。利用TMHMM对松鼠葡萄球菌ExhC基因837bp序列跨膜区进行预测,结果显示ExhC蛋白的第1~277位氨基酸在细胞膜外,5~25位氨基酸所在位置为跨膜区。通过ExhC氨基酸序列分析和ExhC蛋白二级结构、三级结构预测,推断第97位氨基酸插入Asn以及其他位点氨基酸的突变可能会导致松鼠葡萄球菌功能区变化和毒株毒力的相对变化,这将给松鼠葡萄球菌致病机理的研究奠定基础。     

Pathogenesis and management of wound infections in domestic animals

Abstract The pathogenesis of wound infections is largely dependent on adherence mechanisms and toxins. Studies of Staphylococcus intermedins indicate that pyoderma isolates can bind to extracellular matrix proteins exposed in wounds but interpretation of adherence studies is complicated as some organisms possess multiple mechanisms. Studies of blocking and promotion of adherence by antibiotics also show variability. Epidermolytic toxins are recognized in S. aureus and S. hyicus but not in S. intermedins, although a synergohymenotropic toxin has been described and canine syndromes occur where epidermal splitting and S. intermedins infection co-exist. Staphylococcal enterotoxins and toxic shock toxin-1 are recognized as superantigens which cause cytokine release non-specifically, promoting inflammation in wounds. Treatment of infected skin depends largely on antibiotics but drug resistance will limit this; a move towards vaccines and re-examination of the value of antisepsis is occurring. Use of dressings which reduce microbial growth must also be a factor in wound management. Resumen La patogenesis de las infecciones de heridas depende en gran medida de los mecanismos de adherencia y de las toxinas. Algunos estudios en Staphylococcus intermedius indican que los aislamientos a partir de áreas de pioderma pueden adherirse a proteinas de la matriz extracelular expuesta en las heridas aunque la interpretación de estudios de adherencia es complicado ya que algunos organismos poseen múltiples mecanismos. Los estudios con antibióticos sobre su capacidad de bloqueo y promoción de la adherencia también muestran variabilidad. Se reconocen toxinas epidermolíticas en S. aureus y S. hyicus pero no en S. intermedius, aunque se ha descrito una toxina sinergohimenotrópica y se producen sindromes caninos en áreas de coexistencia de rotura epidérmica y S. intermedius. Las enterotoxinas estafilocócicas y la Toxina-1 de Shock Tóxico son reconocidas como superantígenos que causan liberación inespecífica de citoquinas, promoviendo la inflamación a nivel de las heridas. El tratamiento de la piel infectada depende en gran medida de los antibióticos, aunque esto se encuentra limitado por las resistencias; se está tendiendo a las vacunaciones y a una re-evaluación del valor de la antisepsia. El uso de vendas que reduzcan el crecimiento bacteriano deberia también ser un factor en el manejo de heridas. [Noble, W.C., Lloyd, D.H. Pathogenesis and management of wound infections in domestic animals (Patogenesis y manejo de heridas infectadas en animales domesticos). Veterinary Dermatology 1997; 8 : 243–248] Zusammenfassung Die Pathogenese von Wundinfektionen hängt hauptsächlich von Haftungsmechanismen und Toxinen ab. Studien von Staphylokokkus intermedius weisen nach, dass Isolate von Pyodermien sich an in Wunden exponierte extrazelluläre Matrixproteine binden; die Interpretation dieser Haftungsstudien wird durch multiple Mechanismen einiger Organismen kompliziert. Studien, diese Haftung durch Antibiotika zu blockieren oder zu fördern, zeigen variable Ergebnisse. Epidermolytische Toxine sind für S. aureus und S. hyicus, aber nicht für S. intermedius beschrieben, obwohl von einem synergohymenotropischen Toxin berichtet wird und beim Hund Syndrome auftreten, in denen epidermale Spaltung und S. intermedius Infektion koexistieren. Enterotoxine und Toxischer Schock Toxin 1 von Staphylokokkus werden als Superantigene anerkannt, die nicht spezifische Zytokinfreisetzung verursachen und so die Entzündung in Wunden fördern. Die Behandlung infizierter Haut erfolgt weitgehend durch Antibiotika, aber Resistenzbildung wird deren Verwendung einschränken; im Moment geht die Tendenz mehr in Richtung Impfungen und die Neubewertung von Antisepsis. Die Verwendung von Verbandsmaterialien, die das Wachstum von Mikroorganismen einschränken, muss in der Wundversorgung berücksichtigt werden. [Noble, W.C., Lloyd, D.H. Pathogenesis and management of wound infections in domestic animals (Pathogenese und Versorgung von Wundinfektionen bei Haustieren). Veterinary Dermatology 1997; 8 : 243–248] Résumé La pathogénie des plaies infectées dépend largement de mécanismes d'adhérence et de toxines. L'étude de Staphylococcus intermedius montre que des germes de pyodermite peuvent adhérer aux protéines des matrices extracellulaires mises à nu par des blessures mais l'interprétation des études d'adhérence est compliquée par le fait que certains germes possèdent de multiples mécanismes. Des études d'inhibition ou d'activation d'adhérence par des antibiotiques démontrent également une variabilité. On connait l'existence de toxines épidermolytiques chez S. aureus et S. hyicus mais pas chez S. intermedius, bien qu'une toxine synergohymenotropique ait été décrite, et que des syndrômes où clivage épidermique et infection àStaphylococcus intermedius coexistent aient été décrit chez le chien. II est admis que des entérotoxines staphylococciques et la toxine 1 du choc toxique agissent comme des superantigènes qui provoquent une libération non spécifique de cytokines, provoquant l'inflammation des plaies. Le traitement des plaies infectées dépend largement des antibiotiques mais est limité par le phénomène d'antibiorésistance; actuellement, une tendance à reconsidérer la valeur des vaccins et de l'antisepsie se dessine. L'utilisation de pansements qui réduisent la prolifération bactérienne peut également être un facteur du traitement des plaies. [Noble, W.C., Lloyd, D.H. Pathogenesis and management of wound infections in domestic animals (Pathogénie et traitement des plaies infectées chez les animaux domestiques). Veterinary Dermatology 1997; 8 : 243–248]