杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析

以陕西杨凌番茄生产基地感病（TYLCV 症状）番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl（GenBank 序列号：KC293824,未公布）;克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明：获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒（TYLCV-Yl）分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79～97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组：TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
（TYLCV-Yl）属于TYLCV 亚组Ⅰ。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

云南番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

在云南省元谋县发现大量下部叶片褪绿黄化,顶叶卷曲畸形的番茄植株。将叶片采集带回实验室,采用番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的特异性引物分别扩增得到774和400 bp的目标条带,测序比对发现其与ToCV的KR184676.1和TYLCV的FJ012359.1序列相似度均为99%,确认这两条带对应的两种病毒分别为ToCV和TYLCV,明确该番茄植株被ToCV和TYLCV复合侵染。同时发现云南地区有B型和Q型两种烟粉虱存在,且Q型的比例高于B型,二者均可携带ToCV和TYLCV。ToCV首次在云南省发现,其由沿海向内陆蔓延的过程中与TYLCV的复合侵染已蔓延至西南地区,值得高度重视和警惕。     

江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测

2014年对江苏地区的番茄黄化曲叶病进行调查时发现,采自南京温室大棚的17份表现矮化,上部叶片上卷、变小、叶缘黄化,下部叶片脉间褪绿、上卷、变厚症状的番茄病株样本中除了感染烟粉虱传双生病毒外,还有一种长线形病毒,序列分析结果显示烟粉虱传双生病毒为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),长线形病毒为番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)。同时还对发病棚室中采集的烟粉虱进行了两种病毒的检测,结果两种病毒在烟粉虱体内都有检测到。     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

我国6个省份番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染率及序列系统发育分析

于2017～2019年在我国6个省份的番茄主产区，采集疑似番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）和（或）番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的番茄样本，利用特异性引物进行RT-PCR 或PCR 扩增，将符合预期条带大小的PCR 产物测序后进行系统发育分析。结果表明，我国6 个省份番茄ToCV 和TYLCV 的复合侵染率为25.29%，其中山东省两种病毒复合侵染率最高，为46.43%。序列分析结果表明，测定的ToCV CP 基因序列与已报道的对应序列同源性在98.30% 以上，ToCV CP 基因序列没有发生明显的遗传分化；TYLCV 基因组部分序列与已报道的对应序列同源性在96.00% 以上，没有发生明显的遗传分化。     

番茄褪绿病毒在湖南省首次发生

2016年7月在湖南省蔬菜病害调查中发现,4种茄科蔬菜表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状,疑似被番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)感染,同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用To CV热激蛋白(heat shock protein 70,HSP70)序列的特异性引物对采集的番茄、茄子、辣椒、马铃薯样品和烟粉虱样品进行RT-PCR检测,均扩增出目标条带,且扩增序列与北京番茄To CV分离物(KC887999.1)部分序列相似度为99.0%,确认采集样品被To CV感染。4种茄科蔬菜To CV的感染率达70%~100%;发病叶片上烟粉虱的带毒率为66.7%~87.5%;鉴定出烟粉虱的生物类型为MED烟粉虱。这是湖南省首次确认该病毒,需要引起关注和加强防范。     

抗番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）樱桃番茄 新品种丽晶T2 的选育

丽晶T2 是以PHM12-11 为母本,PDM12-3C2-9 为父本配制而成的圆球形粉果樱桃番茄一
代杂种,无限生长类型,中早熟,高抗番茄花叶病毒（ToMV）,抗番茄黄化曲叶病毒（TY）,果实硬度中
上,不易裂果,单果质量20 g 左右,可溶性固形物含量8.5%,果实粉亮,商品性好。秋冬茬栽培平均每
667 m ² 产量6 800 kg,适合北方地区保护地秋延迟和秋冬茬栽培。     

河北省设施番茄褪绿病毒分子检测和鉴定研究

以2014年夏季在河北7个县市设施番茄种植区田间采集的疑似番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)感病植株为试材,采用RT-PCR检测、BLAST比对和MEGA 5.0系统树分析等方法,研究河北设施番茄上ToCV的发生和分子鉴定以及ToCV与另一种严重发生的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLC)复合侵染情况。结果表明:以ToCV外壳蛋白(Coat Protein,CP)和热激蛋白(Heat Shock Protein 70,HSP70)共3对特异引物对其中4个典型地区ToCV疑似样品进行检测,分别扩增到约1 032、943、911bp的特异条带,同时针对ToCV阳性样品利用TYLCV特异引物从部分样品中扩增得到约833bp的核苷酸序列,4个样品均确定为ToCV阳性,样品与ToCV北京分离物(KC887999)CP基因序列一致性最高,为99.7%,同时确定田间存在ToCV和TYLCV复合侵染。     

PaLCuCNV和TYLCCNV复合侵染引起更严重的番茄黄化曲叶病

 从四川攀枝花市田间采集36份表现严重矮化、黄化和曲叶症状的番茄病株样本,利用双生病毒简并引物PA/PB从所有样本中均扩增得到约500 bp的片段,经全序列测定及分析,检测出中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV）和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）,这两种双生病毒的复合侵染率达97.2%。系统进化分析表明,这两种双生病毒分别与已报道的PaLCuCNV河南番茄分离物（PaLCuCNV-[HeNZMI]）及TYLCCNV云南元谋烟草分离物（TYLCCNV-[Y295]）的核苷酸序列相似性最高,分别为99.1%和97.9%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNA β分子,全序列测定表明所得9个DNA β分子均为TYLCCNV的卫星TYLCCNB,且与其四川番茄分离物（TYLCCNB-[SC65]）的核苷酸序列相似性最高,为87.7% ~ 94.5%。本文首次报道PaLCuCNV与TYLCCNV/TYLCCNB病害复合体复合侵染番茄引起更严重的番茄黄化曲叶病。     

河南番茄褪绿病毒的分子鉴定

2014年在河南省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地发现大量保护地番茄植株的叶脉间出现褪绿症状,疑似由番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)侵染引起。以这5个地区的番茄病叶为样本提取总RNA,利用ToCV HSP70h(Heat shock protein 70 homolog,热激蛋白70家族)基因的特异引物对样本进行RT-PCR检测,均扩增出约460bp大小的目的条带。PCR产物测序和序列分析结果表明,该序列与国际上报道的ToCV HSP70h的序列相似性达到99%以上,表明ToCV是为害河南省番茄产区造成褪绿症状的主要病原之一。     

番茄褪绿病毒病研究进展

番茄褪绿病毒于1998年在美国佛罗里达州被首次报道,现已蔓延至世界各地。在中国,番茄褪绿病毒病自2004年在台湾出现以来,已在山东、河南、河北、天津、北京等番茄主产区大面积发生,成为继番茄黄化曲叶病毒病之后的又一种重要病害。对番茄褪绿病毒的特征特性、危害情况以及番茄抗性资源的鉴定等研究进展进行综述,以期为抗病育种、抗病基因的分子标记开发、基因定位和克隆等提供参考。     

几种化学药剂防治日光温室番茄褪绿病毒病研究初报

为明确化学防治对日光温室番茄褪绿病毒病的防控效果,通过田间试验和室内PCR检测,评价应用化学杀虫剂防治Q型烟粉虱对日光温室番茄褪绿病毒病的防控作用,并研究病毒抑制剂对日光温室番茄褪绿病毒病的防控效果。试验结果表明,喷施杀虫剂防控Q型烟粉虱后日光温室番茄植株带毒率可降至3.00%。病毒抑制剂20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂、0.5%葡聚烯糖可溶粉剂、30%毒氟磷可湿性粉剂在试验条件下对番茄褪绿病毒病的防治效果为44.08%~52.63%,可在一定程度上减轻番茄褪绿病毒病的危害。     

河南部分地区番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染的分子鉴定

为调查河南省部分地区番茄病毒病危害情况,于2019年10月采集16份表现黄化、曲叶症状的番茄植株,利用分子生物学技术对其进行鉴定。结果表明:供试样品均被TYLCV(Tomato yellow leaf curl virus)侵染,31.75%的样品被TYLCV和ToCV(Tomato chlorosis virus)复合侵染;DNA全序列比对分析发现,供试样品中分离的TYLCV河南菌株与TYLCV-Is等地区的核苷酸序列同源性均达到94%以上,其中TYLCV-HN-AY-1分离物与TYLCV-Almeria(NC004005.1)序列相似性最高,为99.5%;对供试样品TYLCV抗病基因分子检测发现,部分番茄样品含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a,表明部分TYLCV株系已突破Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a的抗性。该结果对指导河南省番茄的安全生产具有重要意义。     

山东地区茄子感染番茄褪绿病毒的分子鉴定

为明确山东地区番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)侵染茄子的情况,采用RT-PCR分子检测鉴定疑似感染To CV的茄子叶片样品及发病茄子植株上的烟粉虱(Bemisia tabaci)体内To CV的带毒情况。结果表明:10份茄子叶片样品中有6份扩增得到约463 bp的特异条带,经测序与Gen Bank中To CV序列相似性达到99.0%以上,To CV检出率为60%;系统进化分析显示,山东寿光地区To CV茄子分离物cp-1与北京番茄分离物BJ亲缘关系最近。温室内发病茄子植株上的烟粉虱体内携带To CV,带毒率为70%。