藏羊脂联素基因多态性及其与产肉性能的相关性分析

利用高分辨率熔解曲线技术对176头2周岁的甘肃藏羊（欧拉型、甘加型、乔科型）脂联素基因SNPs位点进行检测,运用GLM模型将检测到的SNPs位点与部分胴体及肉质性状的相关性进行了分析.结果表明：在脂联素第2外显子发现＋67G＞C突变使编码氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺;GG、GC基因型个体的宰前活重、胴体重均显著高于CC型（P＜0.05）.说明脂联素基因该位点可能是影响藏羊胴体及肉质性状的主效QTL或与之紧密连锁,可作为藏羊高档羊肉生产的候选分子标记.     

牛脂联素基因cDNA克隆

应用RT-PCR方法先提取成牛肝脏外部脂肪和犊牛大网膜前脂肪细胞培养物(第13日龄)总RNA,先后扩增出ADPN cDNA的501 bp片段基因,分别克隆到载体PMD18-T中,构建重组载体PMD18-T/牛ADPN1和PMD18-T/牛ADPN2。筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。结果表明：ADPN1和ADPN2 2次测序结果完全一致；从脂肪组织总RNA中扩增得到501 bp片段ADPN基因,其cDNA序列与GenBank牛ADPN基因序列同源性为85%,其氨基酸同源性为96%。     

牛脂联素基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

应用RT-PCR方法扩增牛脂联素(Bovine adiponectin,BovADPN)基因,连接到载体pMD18-T中;测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确,经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段,并将其定向克隆到pPICZαA载体中,构建重组质粒pPICZαA-BovADPN.用Sac Ⅰ酶切使其线性化,以化学方法(LiCl)转化入感受态毕赤酵母细胞GS115;重组子经高质量浓度Zeocin(1 000 mg/L)筛选、MDH/MMH平板筛选、PCR鉴定后,用1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot分析.结果表明,所获得的酵母重组子能够分泌表达出相对分子质量为40 000的重组蛋白.     

脂联素受体表达的调节机制

脂联素是一种脂肪细胞分泌的蛋白因子,在人和动物体内通过其受体的介导来发挥多种生理功能,尤以增敏胰岛素、调节糖代谢和脂代谢、保护内皮细胞和对抗炎症等作用重大.本文就脂联素受体1和2的结构和分布、影响它们表达的因素及其机制的进行了综述.     

脂联素与脂联素受体的研究进展

脂联素是脂肪细胞特异分泌的细胞因子，起调节糖类和脂类代谢的作用。作者就脂联素的来源、结构，对糖和脂代谢的调控、表达及其受体的研究进展作一综述。     

鸭脂联素基因全长cDNA的克隆和原核表达的研究

本研究旨在通过克隆鸭脂联素(Adiponectin)基因序列并进行序列分析,揭示该基因的序列特征、组织特异性表达规律,并对其进行原核表达。采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE的方法从鸭脂肪组织总RNA中扩增脂联素基因cDNA片段;半定量RT-PCR检测组织表达特异性;构建原核表达载体,建立原核表达体系。从鸭脂肪组织中得到3个脂联素基因cDNA片段,克隆测序后,拼接获得了鸭脂联素基因1374bp全长cDNA序列,其包含一个长度为738bp完整的开放阅读框,编码245个氨基酸;编码区与鹅、鸡脂联素基因序列的同源性分别为94.9%和86.0%,与人、小鼠、狗等物种脂联素基因的同源性在64.2%～67.0%之间;氨基酸序列比较可知,鸭与鹅、鸡的脂联素氨基酸的同源性分别达95.5%和84.0%,与人、小鼠、狗等哺乳动物的同源性在65%左右。半定量RT-PCR研究结果表明脂联素基因在所测组织中均表达,且高度表达于脂肪组织、肌胃、小肠、心和骨骼肌,中度表达于肺、腺胃、卵巢和脾组织中,而在肝、肾和间脑中低度表达。构建得到在其C端含有8个组氨酸的鸭脂联素融合蛋白表达载体pET41a-duck-adp,重组表达质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌中表达,经IPTG诱导后并SDS-PAGE检测获得了30ku的鸭脂联素原核表达蛋白。脂联素基因在动物进化中具有一定的保守性,该基因在不同组织中表达水平不同,通过原核表达可获得鸭脂联素的重组蛋白。     

脂联素的生理作用及其在养猪中的应用前景

脂联素是脂肪组织特异性分泌的一种脂肪细胞因子,具有调控生物体的能量稳态、葡萄糖代谢和脂肪代谢等功能。它通过降低脂肪沉积的效应、减重效应及对胰岛素的增敏效应调控能量分配;此外,还具有抗炎、抗血管损伤功能,可能为治疗相关的动物疾病提供新的靶点。本文介绍了脂联素的来源、分子结构、生物学功能及影响其分泌的因素,阐述了脂联素对动物脂肪沉积的影响及其在脂肪-骨骼肌信号通路中的作用,展望了脂联素在养猪生产中的应用前景。     

武定鸡脂联素基因多态性分析

[目的]对武定鸡脂联素基因（NC_006096）第1外显子上的c.A99G突变位点进行多态性分析。[方法]翅静脉采集67只武定鸡全血,提取基因组DNA,采用PCR-RFLP法分析Hsp92Ⅱ限制性内切酶对PCR产物进行单酶切的结果。[结果]在c.A99G同义突变位点上存在AA、AB和BB 3种基因型,其中A基因频率为0.686 6,B基因频率为0.313 4;PIC=0.337 8,表明该位点为中度多态位点;χ²适合性检验表明,脂联素基因c.A99G位点处于平衡状态。[结论]采用PCR-RFLP法可有效检测武定鸡脂联素基因c.A99G突变,该位点有3种基因型,等位基因呈中度遗传多态水平且处于平衡状态。     

无量山乌骨鸡脂联素基因的多态性分析

采用PCR-RFLP（聚合酶链式反应—限制性片段长度多态）方法对无量山乌骨鸡208个个体的脂联素基因（NC_006096）第1外显子上的Hsp92 Ⅱ酶切位点的c.A99G突变、第2外显子上的Mva Ⅰ酶切位点c.C565G突变进行检测。结果显示, 在c.A99G 位点有AA、AB和BB 3种基因型, c.C565G位点有CC、CD和DD 3种基因型。对2个位点群体遗传学特性分析的结果表明, c.A99G位点多肽信息含量为中度多态, 而在c.C565G 位点多肽信息含量为低度多态。经χ²适合性检验表明群体在2个位点均处于平衡状态。     

重组脂联素对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体mRNA表达的影响

脂联素（Adp）是主要由脂肪组织分泌的细胞因子,有重要的生理作用。本试验旨在研究重组脂联素（rAdp）对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体2,AMP激活蛋白激酶（AMPK）、过氧化物增殖剂活化受体α（PPARα）mR-NA表达的影响。选择10d皖南花猪皮下脂肪组织分离前体脂肪细胞,增殖培养至80%融合后换分化培养基培养,细胞分化后用0、2和10mg/L rAdp分别处理12和48h。油红O染色法鉴定脂肪细胞,MTT方法检测细胞活力;酶法测定培养液中甘油释放量,荧光定量RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素（Adp）、脂联素受体1（AdpR1）、脂联素受体2（AdpR2）、PPARα和AMPK mRNA表达。结果显示,rAdp处理后,脂肪细胞活力总体有降低趋势,10mg/L处理48h达到显著水平（P〈0.05）;rAdp处理对甘油释放的抑制作用未达到差异水平。rAdp处理12h后,脂肪细胞AdpR1和AdpR2mRNA表达显著升高（P〈0.01）,但无剂量依赖性;rAdp处理48h后,脂肪细胞AdpmRNA表达显著下降（P〈0.05）。rAdp处理12h后,脂肪细胞PPARαmRNA表达显著升高（P〈0.01）,且有剂量效应性;而AMP AMPK mRNA表达均无显著性变化。结果提示,重组脂联素处理猪原代脂肪细胞有降低细胞活力和抑制脂肪细胞甘油释放量的趋势,能显著上调AdpR1、AdpR2和PPARα基因的表达,从而刺激脂肪酸氧化和甘油三酯的水解作用。     

徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备

旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性。采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP。脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达。利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1。徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89%、76%、85%、84%、93%、91%、70%,氨基酸序列同源性为90%、79%、88%、97%、95%、94%、72%。成功构建融合表达载体pEGFP-H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达。目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中)。通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达。本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的。该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达。     

湖羊和徐淮山羊CaSR基因组织表达水平的初步分析

为分析钙敏感受体(CaSR)基因对湖羊和徐淮山羊消化吸收的作用,以6个月龄的湖羊和徐淮山羊为试验材料,利用荧光定量PCR SYBR GreenⅡ荧光染料法,对湖羊和徐淮山羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠10个组织中CaSR基因的表达水平进行相对定量分析。结果表明:在湖羊的样品组织中,CaSR基因在十二指肠中表达量最高,其次是回肠,两者的表达量差异达到显著水平(P0.05);CaSR基因在瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、空肠、盲肠、结肠、直肠中的表达量显著低于在十二指肠及回肠中的表达量(P0.05)。在徐淮山羊的组织样中,CaSR基因在回肠中的表达量最高,其次是十二指肠,且二者差异显著(P0.05);另外,该基因在回肠和十二指肠的表达量显著高于在瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、空肠、直肠中的表达量(P0.05),盲肠和结肠中该基因的表达量最低。通过试验说明CaSR在不同组织里的表达具有特异性,在不同的物种间主要表达组织也不同,表明湖羊和徐淮山羊具有不同的消化吸收方式。     

山羊组织蛋白酶L基因克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在克隆山羊组织蛋白酶L(cathepsin L,CTSL)基因,并进一步探讨该基因结构与功能的关系,揭示其组织表达规律。本研究以天府肉羊为试验材料,运用同源序列克隆技术,对山羊CTSL基因进行克隆,并对其进行生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,山羊CTSL基因编码区(CDS区)长1005 bp,共编码334个氨基酸;山羊CTSL氨基酸与绵羊的同源性最高(99.10%),其次是牛(96.71%)、猪(90.12%)、人(76.95%)、大鼠(76.12%)、小鼠(75.82%)、青鳉鱼(66.17%)和斑马鱼(61.42%);经预测山羊CTSL可能含有1个Inhibitor_129结构域和1个Pept_C1结构域;山羊CTSL基因在11个组织中均有表达,但在肺脏和肾脏中的表达量显著高于在心肌、肝脏、脾脏、胸肌、腹肌、腿肌、膈肌、眼肌和比目鱼肌中的表达量（P<0.05）。     

肉碱棕榈酰转移酶基因在绵羊和山羊不同肌肉组织中的表达分析

采用实时荧光定量PCR方法比较分析了肉碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase,CPT)基因在绵羊和山羊不同组织中的表达差异。研究结果表明,CPT1A mRNA在绵羊肝脏、脾脏中表达明显高于CPT1B、CPT2,CPT1B mRNA在绵羊腹外斜肌中的表达明显高于CPT1A、CPT2。CPT1A mRNA在山羊脾脏中表达明显高于CPT1B、CPT2 mRNA在山羊脾脏中的表达,CPT1B mRNA在山羊后腿股二头肌、腹外斜肌中的表达明显高于CPT1A、CPT2 mRNA在山羊后腿股二头肌中的表达。CPT1A mRNA在绵羊肝脏中的表达显著高于山羊中CPT1A mRNA的表达(P＜0.05)。CPT1A、CPT1B、CPT2基因在绵羊心脏、脾脏、腰大肌中的表达显著高于在山羊中的表达(P＜0.05),CPT1A、CPT1B、CPT2基因在山羊后腿股二头肌中的表达显著高于在绵羊中的表达(P＜0.05)。CPT1A、CPT1B、CPT2基因在绵羊、山羊各组织中的表达存在差异,可能与各基因表达模式、肌肉组织纤维类型、脂肪沉积含量不同等因素有关。     

金堂黑山羊白介素10基因的克隆及表达分析

为探究山羊白介素10（interleukin 10,IL-10）基因的序列特征及在组织中的相对表达情况,试验采用PCR法扩增并克隆金堂黑山羊IL-10基因,用DNAMAN、DNAStar、ExPASy等生物信息学软件进行序列分析,运用实时荧光定量PCR法检测IL-10基因在金堂黑山羊不同组织中的表达情况。结果显示,金堂黑山羊IL-10基因序列长为379 bp,开放阅读框为276 bp,编码91个氨基酸残基。IL-10蛋白二级结构中含有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,分别为76.92%、2.20%和20.88%。IL-10蛋白三级结构模型与人IL-10（1ilk.1.A）基因同源性最高（86.81%）。系统进化分析结果发现,金堂黑山羊IL-10基因与挪威山羊IL-10基因亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测发现,在金堂黑山羊肺脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏、肌肉和肾脏（P<0.05）,在肾脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏和肌肉（P<0.05）,在脾脏、心脏和肌肉中IL-10基因表达水平较低,但差异不显著（P>0.05）。本试验结果揭示了IL-10基因具有高度的保守性,可能参与调控山羊的免疫应答反应。     

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础。从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体。序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%。本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低。Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性。该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据。     

绒山羊不同肌肉组织及肌内脂肪细胞的基因表达分析

试验旨在研究脂肪沉积关键基因在内蒙古白绒山羊的表达规律,以期深入分析绒山羊肌内脂肪沉积特征.利用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ、FTO、Lipin、LPL、HSL、A-FABP和Perilipin7个基因在绒山羊10个不同肌肉组织及肌内前体脂肪细胞分化的3个时期(早期(D3)、中期(D7)、末期(D11))、诱导分化关键时间点(24、48、72和96 h)的变化,分别从组织和细胞角度对其进行分析,并研究其与肌内脂肪含量的关系.结果表明,FTO基因的表达水平高于其他基因;Lipin基因的表达量最低;LPL和HSL是脂肪合成和分解的关键酶类,其表达趋势大致相同,仅仅在腰大肌和斜方肌这两个部位的表达模式相反.A-FABP和Perilipin基因表达模式也较为特殊,整体表达量较低,前者仅仅在胸下矩肌中有较高表达,后者在股二头肌中有较高表达.从细胞水平分析发现Lipin、PPARγ、A-FABP和Perilipin的表达模式相似,随着前体脂肪细胞培养日龄的增加和甘油三酯的积聚,其表达量逐渐升高;Lipin基因在各个时间点的表达丰度极低;HSL基因的表达量随分化程度的升高而逐渐降低;Perilipin基因仅仅在诱导分化的后期有较高表达.相关性统计分析发现,PPARγ基因mRNA与肌内脂肪多呈负相关;而其他成脂基因HSL、LPL、FTO、Lipin、Perilipin、A-FABP mRNA与肌内脂肪含量多呈正相关.因此,脂肪沉积关键基因的表达具有特异性,总体上看基因表达量为FTO> PPARγ> LPL >HSL> A-FABP >Perilipin >Lipin,该结果为进一步研究脂肪沉积机制及优化山羊肉品质奠定基础.     

海南黑山羊CAST基因的时空表达分析

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术检测了CAST基因在1、2、3、4月龄和12月龄海南黑山羊骨骼肌、心肌、肝脏和脂肪组织中mRNA表达差异和发育规律,为揭示CAST基因的生物学功能及其对肉质的表达调控机理提供参考依据.结果表明,CAST基因在未成年羊的骨骼肌中mRNA表达量极显著高于其他组织（P＜0.01）,且在2月龄时达到最高水平;成年后在心肌、肝脏和脂肪中的表达量极显著升高（P＜0.01）,在骨骼肌中的表达量次之,但在脂肪中的表达量始终相对较低;该基因在3、4月龄各组织中的mRNA表达量相对较低,且四种组织在3、4月龄间表达差异不显著（P＞0.05）.     

Analysis of Clone and Prokaryotic Expression of Canine Parvovirus VP2 Gene

The study was aimed to investigate the epidemic situation of canine parvovirus in Hebei and Gansu provinces.VP2 protein was expressed by prokaryotic system and polyclonal antibodies were prepared, which provided a basis for the further researches on pathogenesis and therapy of canine parvovirus.Virus genomic DNA was extracted from 10 epidemic materials of suspected infected dogs and VP2 gene was amplified.The target fragments of VP2 gene were cloned to pET-30a vector after sequencing and analysis, then the positive expression plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) cell.Polyclonal antibodies were prepared by immunizing guinea pigs with the SDS-PAGE identification of purified protein.The genetic analysis results showed that the VP2 gene was successfully cloned and 80% samples were belonged to CPV-2a and 20% samples were belonged to CPV-2b.The isolated strains of the test and part of China strains were gathered into a branch which had certain distance with strains of Korea and USA, and that had low homology with strains of Italy.SDS-PAGE results indicated that the recombinant protein with a molecular weight of 70 ku was expressed by prokaryotic system.Western blotting results showed that the recombinant protein had good immuneoreactivity and immunogenicity.The study indicated that CPV-2a was the predominant gene type in Hebei and Gansu provinces, meanwhile VP2 protein expressed by prokaryotic system had good antigenicity.This research provided a basis for the future study of the prevention and control of canine parvovirus.     

Gene Expression Analysis on Different Muscles and Intramuscular Adipocytes in Cashmere Goat

The objective of this study was to discover the expression of key genes for fatty deposition in Inner Mongolia cashmere goat,so that deeply analysize the change features of intramuscular fat deposition.Real-time PCR was used to detect the expression pattern of seven different genes (PPARγ,FTO,Lipin,LPL,HSL,A-FABP and Perilipin) in ten different muscle tissues,and in intramuscular adipocyte for three periods as early (D3),middle (D7),and end (D11),as well as the changes in key points of induced differentiation time (24,48,72 and 96 h).The correlation between the seven genes and the intramuscular fat content was researched from the prospective of analyzing the tissues and cells.The results showed that FTO gene mRNA had a higher expression in different tissues than that of other genes.While the Lipin gene mRNA expression was the lowest than others,LPL and HSL were the key enzymes in the fat synthesis and splitting,the expression trends of which were basically similar,they only showed the opposite expression pattern in the psoas major muscle,and trapezius A-FABP and Perilipin gene expression patterns were more special,the overall expression level was lower,the former's expression level was higher in next moment chest muscle than other tissues,while the latter's expression level was higher in biceps femoris muscle than other tissues.Analyzing from the cell level,the expression patterns of Lipin,PPARγ,A-FABP and Perilipin were similar,with the increase of adipocytes cultivating day age and the triglyceride accumulation,the corresponding expression level increased gradually;The expression abundance of Lipin gene in each time point was extremely low;The expression level of HSL gene reduced gradually as the differentiation degree increases;The expression level of Perilipin gene was higher only in the late period of induction and differentiation.Through statistical analysis of the correlation,the PPARγ gene mRNA of cashmere goat formed negative correlation with intramuscular fat;While other adipogenic genes like HSL,LPL,FTO,Lipin,Perilipin and A-FABP mRNA formed positive correlation with intramuscular fat content.Therefore,the key gene expression of fat deposition had the specificity,generally,the amount of gene expression by quantitative analysis was FTO> PPARγ> LPL >HSL> A-FABP >Perilipin >Lipin,such results lay foundation for further researching the fat deposition mechanism and improving the quality of cashmere goat.