猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量

为建立一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5′端非编码区设计1对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其他猪源病毒发生非特异性反应。应用实时荧光定量RT-PCR法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明,102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在107~102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感性、特异性、重复性好等优点,可望取代传统的兔热法用于猪瘟疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新的有效工具。     

荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测.结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应.荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验.     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5'非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SY13R GreenⅠ荧光定量RT-PC R方法.试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著.与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×10(2)病毒基因组拷贝数.利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交又免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

利用荧光定量RT-PCR法与间接免疫荧光法比较测定猪瘟兔化弱毒病毒含量

利用荧光定量RT-PCR技术与间接免疫荧光技术(IFA)对12份猪瘟兔化弱毒(ST细胞毒)病毒含量与毒价进行了测定,并与兔体反应热法测定结果进行了比较分析。结果显示:12份猪瘟兔化弱毒(ST细胞毒)可根据兔体感染量分为4组,各组间荧光定量RT-PCR法与IFA法测得的病毒含量间差异极显著(P<0.01);3种方法的检测结果间呈显著正相关性(γ>0.9)。研究结果提示:可用荧光定量RT-PCR技术结合IFA替代传统的兔体反应热法,高通量、快速、准确地测定猪瘟兔化弱毒病毒含量,其有助于简化疫苗检验工作并提高准确度。     

实时荧光定量RT-PCR法比较猪瘟疫苗病毒含量

为有效检测福建省使用猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量,给养殖户选择高效疫苗提供科学指导。本研究收集福建省内使用的10个不同厂家生产的23个批次猪瘟疫苗,应用实时荧光定量RT-PCR方法检测疫苗中病毒核酸的含量,以其中的标准品对照,比较相应的兔体反应量。结果表明：抽检23个猪瘟疫苗样品合格率仅为69.56%,传代细胞苗的病毒含量相对较高,脾淋苗病毒含量优于细胞苗;不同厂家生产的同类型疫苗病毒含量差异大,同一厂家生产的同类疫苗存在批间差异。实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量是一种便捷、高效的方法,为今后临床猪瘟疫苗的使用提供有效指导依据。     

猪瘟病毒的实时荧光RT-PCR检测

应用实时荧光RT-PCR方法对12份猪瘟可疑病料进行了检测,结果有9份为阳性,阳性率为75%（9/12）,并对这12份病料进行猪瘟直接免疫荧光抗体试验,结果与猪瘟实时荧光RT-PCR检测结果基本一致,结果证明,应用实时荧光RT-PCR方法诊断临床中的猪瘟病例可行,并具有快速、准确、敏感的特点。     

鉴别牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的复合PCR方法及其应用

以牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)特异引物 P1/ P3扩增 BVDV标准毒株及以猪瘟病毒 (HCV)特异引物 P2 / P3扩增HCV阳性病料 ,分别扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的特异片段 ;以 P1、P2、P3扩增 BVDV和 HCV人工混合感染样品 ,扩增出大小为 32 6 bp和 2 5 2 bp的 2条片段 ,建立了特异的一步检测 BVDV和 HCV的复合 PCR方法。以建立的复合 PCR方法检测 BVDV分离株 ,都扩增出 1条 32 6 bp的特异片段 ;从吉林等地送检的病料和猪瘟兔化弱毒疫苗中扩增出一2 5 2 bp的特异片段 ,从长岭地区的疑似猪瘟病猪的血清病料中 ,同时扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的核酸片段 ,表明长岭某猪场流行的“猪瘟”为 BVDV和 HCV混合感染。本研究为进行 HCV和 BVDV的鉴别诊断与流行病学调查提供了有效的方法。     

猪瘟疫苗超前免疫效果观察

本试验旨在确定猪瘟首次免疫的最佳时间:试验中将29只仔猪分为3组分别于吸初乳前1 h、吸初乳时、吸初乳后1 h对仔猪进行猪瘟疫苗注射,利用酶标仪检测免疫后15 h3、0 h、40 h、50h时积各组仔猪体内抗体水平。结果显示:超前免疫仔猪抗体水平明显高于其它两组。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株（登录号KJ960180）的M基因保守序列,设计1对扩增片段大小为299 bp的特异性引物,经PCR扩增、克隆、测序鉴定后,提取质粒作为阳性标准品,建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在1.21×10^3~1.21×10^8拷贝/μL范围内呈现良好的线性,相关系数（R2）为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线为单个特异峰,产物Tm值为85.5~86℃,最低检测限为1.21×10^1拷贝/μL。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、成本低且操作简单,适用于PEDV的早期诊断、定量研究和流行病学监测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染抑制猪瘟疫苗的免疫应答

对20日龄SPF猪和20日龄猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）血清阳性猪，人工感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北京分离株（BJ－4）后48h接种猪瘟疫苗，利用ELISA方法检测仔猪针对PRRSV和猪瘟疫苗的体液免疫，利用MTS法检测仔猪外周血单核细胞对有丝分裂原ConA的刺激反应。结果表明，不论是SPF仔猪还是带有PRRSV抗体的仔猪，在鼻内接种PRRSV后48h接种猪瘟疫苗，其对猪瘟疫苗的抗体反应显著低于对照组，对有丝分裂原ConA的刺激反应也下降。由此说明，PRRSV感染使仔猪对猪瘟疫苗的免疫应答受到抑制。     

我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异

采用 RT-PCR方法 ,从我国 1 0个省、市、自治区收集的 2 3个猪瘟病毒 ( CSFV)流行毒株中 ,扩增了CSFV E2基因中主要抗原位点编码区。对各扩增片段进行了序列测定 ,通过计算机分析构建了系统发生树 ,并确定了它们间的遗传相关性。结果表明 ,2 3个流行毒株中的 1 8株属基因 群 ,占 78.2 6%;另外 5个流行株与传统石门强毒、兔化弱毒株属基因 群 ,占 2 1 .74 %。两群间测序区的核酸同源性只有 78.90 %。此外 ,根据序列差异程度 ,将基因 群流行株分为 3个亚群 ,各基因群 CSFV在地域分布上未发现有明显的特征性。本研究初步揭示了我国较大范围内流行的 CSFV毒株与传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异 ,以及我国猪瘟病毒流行株在地域分布上的多样性     

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks.     

体外培养细胞中特异反义RNA表达对猪瘟病毒增殖的抑制作用

应用免疫荧光抗体技术检测了整合有猪瘟病毒反义基因的ＰＫ－１５细胞克隆对猪瘟病毒的抑制效应。结果表明，５个不同的反义基因片段对猪瘟病毒的抑制效率存在很大的差异，其中Ａ片段的抑制效率最高（９４％～９８％），Ｂ片段次之（５８％～７６％），Ｃ片段再次（６４％以下），Ｄ片段和Ｅ片段未见明显的抑制效应。抑制效率的差异可能与反义基因片段的位置、长短以及反义ＲＮＡ表达质粒载体有关。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

Peste des petits ruminants virus (PPRV) and goat pox virus (GTPV) are the causative agents of two kinds of goats’ diseases-peste des petits ruminants and goat pox which can cause disaster economic losses. In order to detect the two viruses simultaneously and quickly, two sets of primers and relative probes were designed based on the nucleoprotein (N) gene of PPRV and the inverted terminal repeat (ITR) segment of GTPV, respectively. In order to work together in the same reaction, the probes were labeled with different fluorescent materials 5′FAM-TAMRA3′and 5′JOE-Eclipse3′,respectively. Results showed that the duplex Real-time RT-PCR assay was identified to be specific for PPRV and GTPV only and specific fluorescent signal could be detected, but the related viruses including fowl pox virus（FPV）and canine distemper virus (CDV) had no specific fluorescent signal. Positive recombinant plasmids (PPRV pMD18-T-N and GTPV pMD18-T-ITR) were built and used for positive quantitative templates to establish duplex standard curves. The developed assay based on the probe N-ITR was found to be highly specific and sensitive with a detection limit of 10² copies/μL cDNA and 10³ copies/μL DNA for PPRV and GTPV, respectively. Finally, the duplex Real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of PPRV and GTPV was established preliminarily in the study.