猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

7株猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析

为了研究分离的猪圆环病毒2型基因序列,根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计1对引物,通过PCR方法从采自不同地区的7份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM-WS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV2的ORF2基因,并将获得的ORF2基因片段分别克隆入pMD18-T载体,通过筛选获得重组质粒,分别命名为pMD-PCV2-HN01、pMD-PCV2-DY01、pMD-PCV2-HM01、pMD-PCV2-SDqd01、pMD-PCV2-SDqd02、pMD-PCV2-SDqd03、pMD-PCV2-PD01,并进行测序及序列分析。结果表明:HN01株ORF2基因全长为705 bp,另外6株ORF2基因全长均为702 bp;7株分离株的ORF2基因核苷酸序列同源性较高,为94.0%～99.9%,氨基酸序列同源性达93.6%以上;7株分离株与GenBank中登录的德国株和台湾株的核苷酸序列同源性较低,分别为91.7%～93.2%和89.0%～90.5%,而与丹麦、法国、中国株的核苷酸序列同源性较高,达94.0%以上,氨基酸序列同源性均达89.3%以上。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

猪圆环病毒2型北京株的分离及基因组序列分析

为了解北京地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2010年病料中分离的2株PCV2通过PCR、IPMA进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar进行序列分析,用MEGA5进行PCV2ORF2序列比对,构建系统进化树。结果表明,分离得到的BJ2010LC株(登录号为JQ002671)、BJ2010PG株(登录号为JQ002672)2个PCV2毒株其全基因组长度均为1 767bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为94.2%～99.5%,2个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.6%。BJ2010LC株属于基因型PCV2d,BJ2010PG株属于基因型PCV2b。     

猪圆环病毒2型山西分离株的遗传变异多样性分析

为了进一步研究山西猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异多样性情况,对山西2013—2016年间分离的9株猪圆环病毒流行株(SXQX、SXCZ、SXJC、SXJX、SXLL、SXPY、SXPG、SXXY、SXTY2株)的全基因组进行了扩增、克隆和测序,已收录入GenBank中。并将其全基因序列、ORF2序列和推导出的Cap蛋白氨基酸序列与不同国家和地区的28株主要流行株进行了遗传变异多样性分析,结果显示:9株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJX、SXXY、SXJC株为1 768bp,其余均为1 767bp,分别约占33%和67%。9株PCV2流行株之间核苷酸同源性为94.7%~99.8%,与国内外28株参考株同源性为93.9%~99.9%,与国产疫苗株同源性(LG、DBN-SXO7-2、SH株)为95.1%~99.8%;PCV2全基因组序列的进化分析表明:本试验分离的SXJX、SXJC、SXXY株属于PCV2a亚型的2D亚群,SXLL、SXPY、SXCZ株属于PCV2b亚型的1C亚群,SXTY14、SXQX、SXPG株属于PCV2b亚型的1A/1B亚群,可见近几年,山西PCV2流行株以PCV-2b亚型为主。分离的9株PCV2的ORF2之间核苷酸和Cap蛋白氨基酸同源性分别为90.0%~100.0%和87.1%~100.0%,与28株参考株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为87.6%~100.0%和84.1%~100.0%,与国产疫苗株核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为91.0%~100.0%和89.3%~100.0%,同源性都较高。9株分离株中,有6株分离株(SXQX、SXTY14、SXPG、SXXY、SXJC、SXJX)Cap蛋白氨基酸为233个,其中SXQX、SXTY14、SXPG株的ORF2位于1 033~1 734bp,SXXY、SXJC、SXJX株的ORF2位于1 034~1 735bp,3株分离株(SXCZ、SXLL、SXPY)Cap蛋白氨基酸为234个,其ORF2位于1 030~1 734bp,而与其他基因组序列为1 767bp分离株的ORF2相比,1 030~1 734bp位置多了3个碱基TCA,导致其氨基酸序列在234位置增加1个K(Lys)。另外还发现9株PCV2Cap蛋白除了唯一糖基化位点(NYS)(第143~145位氨基酸)呈高度保守外,还存在较多的氨基酸变异,这为山西地区PCV2的免疫预防等的研究提供理论依据,并为深入开展PCV2的分子致病机理提供基础理论数据。     

广西北部湾地区猪圆环病毒2型检测及其ORF2遗传变异分析

为了解猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)在广西北部湾地区的流行情况和其ORF2基因的遗传变异规律,本研究采用PCR方法对2016年采自广西北部湾地区规模猪场和农村散养户的306份疑似PCV2感染猪的血液和组织样品进行了PCV2的病原学检测,同时对分离的4株PCV2 ORF2基因进行PCR扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中登录的34株国内外PCV2参考株ORF2序列进行比对和遗传进化分析。结果表明:PCV2检测阳性样品为129份,阳性率为42.16%。随机选取的4份阳性病料PCV2 ORF2基因测序结果显示,4个毒株遗传关系上均属于Group 1(PCV2b),其中BBW-1和BBW-2分离株属于1A分支且分别与Fd3株(AY321984)和NL_PMWS_3株(AY484415)同源性较高,BBW-3和BBW-4分离株属于1B分支且BBW-4分离株与Hu Zhou0301株(AY536756)和NL_Control_1株(AY484407)同源性较高,其ORF2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%~99.5%和93.9%~95.4%,说明该地区PCV2的优势基因型是PCV2b。研究结果不仅有利于掌握广西北部湾地区PCV2流行毒株同源性情况,而且将为该地区(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的防治和新型疫苗的研制提供依据。     

2013~2017年江西省猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为掌握江西地区猪圆环病毒2型（PCV2）的分子流行病学及其遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2017年采集自江西省南昌市、宜春市、新余市、赣州市、吉安市、九江市、上饶市、抚州市、景德镇市、鹰潭市等10个地区的1 082份疑似PCV2感染猪病料组织进行病原学检测,并通过PCR扩增、克隆和基因测序对PCV2的全基因组序列进行分析。研究表明,1 082份病料中有610份为PCV2阳性,总阳性率为56.4%,其中2013~2017年阳性率分别为52.7%、48.8%、58.5%、71.0%和67.4%。共获得89株PCV2全基因组序列,其中有83株为PCV2b基因型,其中53株归类于PCV2b-1C基因亚群,30株归为PCV2b-1A/1B基因亚群;6株为PCV2a型。测序毒株与参考毒株ORF2基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.9%~100.0%和86.0%~100.0%;氨基酸序列分析表明,Cap蛋白存在20个氨基酸突变位点。本研究表明,江西地区猪群中PCV2的主导基因型为PCV2b,其中又以PCV2b-1C基因亚群占据主导地位,同时也存在少量PCV2a基因型。     

猪圆环病毒2型江苏分离株的遗传进化分析

采用PCR方法扩增了15个猪圆环病毒2型（PCV 2）江苏分离株的基因组DNA,以这些毒株的ORF2核苷酸序列进行遗传进化分析。经序列比较发现,所有分离株均属于2b基因群,其中7株为1A/1B亚群、8株为1C亚群;毒株间核苷酸同源性为93.6%~100%,所编码的Cap蛋白氨基酸同源性为92.3%~100%。PCV 2江苏分离株Cap蛋白的主要变异区域为53~90、121~151和190~210位氨基酸;R59、R89、S90、S121、T134、S169、A190、E210为1A/1B亚群分离株的特征氨基酸,而F8、I53、N68、L89、T90、T121、N134、R169、D210、I215、K234则是1C亚群分离株的特征氨基酸。     

广东省4株PCV2型分离株全基因组进化分析

【目的】 了解目前广东省猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）分离株的基因型和进化特征,为广东省PCV2防控及疫苗株的筛选提供参考依据。【方法】 运用PCR方法将4份鉴定为PCV2阳性样品进行PCV2全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析;利用MegAlign软件对4株PCV2广东分离株ORF2氨基酸序列与国内外参考毒株进行关键位点氨基酸变异分析;应用DNAStar中Protean软件的Jameson-Wolf方法对4株PCV2广东分离株ORF2基因编码的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数预测分析。【结果】 测序结果表明,4株PCV2广东分离株序列长度均为1 767 bp。遗传进化树结果表明,4株分离株均属于PCV2d基因型,且核苷酸相似性在97.7%~99.1%之间,与国内外54株参考毒株相似性在91.7%~99.8%之间,其中与PhuTho/G40312/2018株（Viet Nam,登录号：LC602996）、QZ1410株（江苏,登录号：MG732832）、GXBB1501211株（广西,登录号：MH756609）亲缘关系最为接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有8个氨基酸特异性突变位点,分别是Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E、R169G及T216A。抗原指数分析发现,广东省分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第7－12、47－53、80－90、160－170和205－213位氨基酸这5个区域。【结论】 从广东省部分地区分离的4株PCV2均为2d亚型,其Cap蛋白氨基酸序列存在多个突变位点,抗原指数与疫苗株差异较大,提示广东省PCV2的流行趋势逐渐以2d亚型为主。     

猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株全基因组的克隆和序列分析

分离了9株猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）广东地方分离株，并进行了全基因组序列测定；对这9株PCV2广东分离毒株的ORF1和ORF2基因的序列分析表明ORF2的变异程度要比ORF1的变异程度大；对PCV2衣壳蛋白的氨基酸序列同源性比较发现了PCV2毒株间存在1个氨基酸变异程度较大的区域和2个氨基酸变异程度较小的区域，其中前两个区域与两个主要的免疫反应区域相对应；将这9个毒株的全基因组序列与GenBank上收录的18个PCV2毒株的全基因组序列基因进化树分析表明，这9个PCV2广东分离株彼此之间及与国内PCV2分离株、欧洲株之间更接近，而与韩国、中国台湾、日本和美洲毒株之间则稍远，因而在选PCV2疫苗免疫时，建议尽量使用国内生产的疫苗或自制组织灭活疫苗进行免疫。     

凉山州腹泻仔猪猪圆环病毒2型感染情况调查

为了解凉山州腹泻仔猪猪圆环病毒2型(PCV2)的感染情况,采用PCR方法对采自四川省凉山州西昌市和喜德县7个猪场85份腹泻仔猪粪便、病变组织等样品进行PCV2检测,并将扩增到的PCV2 ORF2基因片段进行测序和序列分析。结果显示,PCV2阳性样品有22份,阳性率为25.9%,阳性猪场占71.4%(5/7)。22个ORF2基因片段长度均为459 bp,核苷酸同源性为92.8%～100%,氨基酸同源性为93.5%～100%。构建的系统进化树显示22个测序序列分别处于2个分支:PCV2b和PCV2d,但未形成明显的地理分支。结果表明凉山州猪群中PCV2感染较为普遍,且以PCV2d亚型为主,并存在一定程度的遗传变异。     

猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析

对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近.     

我国部分地区猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解我国猪圆环病毒2型(PCv2)流行毒株遗传变异情况,本研究对本实验室分离到的19株PCV2分离株通过病毒全基因组克隆和测序分析,将其分为2个大基因群和3个亚群,其基因组分别为1 766 nt、1 767 nt和l 768 nt,各占15.8%、73.7%和10.5%.以1 767 nt毒株为基准,其基因组第39或1 039位有1个碱基缺失后突变成1 766 nt毒株;第1 040位有1个碱基插入后突变成1 768 nt毒株.对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705 nt和708 nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸增加.同时,本实验选用Acc I和Fba I内切酶对19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,其结果可作为流行毒株分型鉴别依据.     

ORF1 but not ORF2 dependent differences are important for in vitro replication of PCV2 in porcine alveolar macrophages singularly or coinfected with PRRSV

The objective of this study was to investigate cytokine expression and in vitro replication of porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in pulmonary alveolar macrophages (PAMs) emphasizing PCV2 open-reading frame (ORF) origin (PCV2a or PCV2b) and PRRSV strain. Chimeric PCV2 viruses composed of different combinations of ORF1 and ORF2 of PCV2a or PCV2b (chimera PCV2a-2b and chimera PCV2b-2a) were constructed and five different PRRSV isolates were utilized: Type 1 (SD 01-08) or type 2 (NC16845b, VR-2332, MN-184, JA-142). PAMs were infected singularly or with combinations of PCV2b, PCV2a, chimera PCV2a-2b, and chimera PCV2b-2a, and one of the five PRRSV isolates. Real-time PCR was used to test PAMs (PCV2 mRNA) and supernatants (PRRSV RNA, PCV2 DNA, PCV2 mRNA) harvested at 24, 48, 72 and 96h post inoculation (hpi). Levels of IFN-γ, TNF-α and IL-10 were determined by quantitative ELISAs. PCV2 replication in PAMs was limited to groups inoculated with PCV2 strains containing ORF1 of PCV2a (PCV2a, chimera PCV2a-2b). Furthermore, in supernatants, PCV2 mRNA was only detected in groups coinfected with PRRSV regardless of strain at 48hpi supporting an enhancing effect of PRRSV on PCV2 infection. Changes in cytokine levels were minimal and associated with PRRSV strain for TNF-α. In summary, in vitro differences in PCV2 replication in PAMs inoculated with different PCV2-PRRSV combinations were independent of PCV2 ORF2 origin with minimal effects of concurrent PRRSV infection perhaps indicating that PCV2-specific changes in ORF1 may be more important than those in ORF2.     

5株猪圆环病毒2型全基因克隆和序列分析

为了解广东地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行势态及毒株的基因变异情况,从广东珠三角地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)患病死亡猪中采集淋巴结,将PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上进行增殖培养,成功分离到5株猪圆环病毒2型毒株,分别标记为GD-jm、GD-sz、GD-pz、GD-gj和GD-ss。再从细胞培养物中提取病毒基因组DNA,对5株PCV2分离株全基因组进行PCR扩增并克隆到pMD18-T Simple Vector进行测序,测序结果提交GenBank,登录号分别为JX912914、JX912915、JX945575、JX945576和JX945577。借助相关生物学软件作同源性分析,这5株PCV2基因组长度均为1767 bp,其中3株为PCV2b亚型,2株为PCV2d亚型。