弓形虫529 bp基因的克隆及序列分析

本研究对安徽猪源弓形虫529 bp重复序列进行了分析,为其分子流行病学研究以及诊断方法的建立奠定基础。首先对病料虫体基因组DNA进行提取,然后对弓形虫529 bp基因进行PCR扩增、克隆、测序并对测序结果进行比对、同源性分析和构建系统进化树。结果显示,PCR扩增产物约为528 bp,与已报道的弓形虫同一基因序列具有高度同源性,与GenBank报道的EF648169.1株同源性最高,达99.5%,且遗传距离最为接近;与其他5株猪源弓形虫比对显示主要突变区域在第31～74位和第100～141位碱基。表明该猪源弓形虫与犬源弓形虫EF648169.1株为姊妹株;本基因序列碱基突变较少,保守性较好,适合作为弓形虫病诊断的靶基因。     

弓形虫细胞核因子3基因的克隆及序列分析

为预测弓形虫细胞核因子3(TgNF3)基因作为抗弓形虫疫苗候选抗原的可能性,本试验以弓形虫RH株的总RNA为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TgNF3基因并连接至pMD18-T载体。筛选阳性克隆后,测序鉴定。将测序结果正确的核苷酸序列翻译成氨基酸序列,运用生物信息学软件分析TgNF3蛋白的结构,预测抗原表位。结果显示,TgNF3基因长约950bp。TgNF3蛋白中包含1个跨膜结构域,9个α-螺旋区,4个β-折叠区,8个亲水区域和10个柔性区域,并预测含有9个线性B细胞抗原表位。结果表明,TgNF3蛋白可能具有良好的免疫原性,为研制以TgNF3为抗原的弓形虫亚单位疫苗及表位疫苗奠定了基础。     

刚地弓形虫GRA25基因的克隆及序列分析

本研究旨在对来源于不同宿主和地理分布的22株弓形虫的GRA25基因进行PCR扩增并测序,对获得的GRA25基因序列进行比对,利用MP和ML两种方法对不同分离株的GRA25基因构建系统进化树。利用生物信息学软件将弓形虫RH株的GRA25基因翻译成氨基酸序列,对其编码蛋白的生物学特征进行分析。结果显示,弓形虫GRA25基因序列有2种长度,分别为939和948 bp。序列比对结果显示,GRA25基因在不同虫株间有82个核苷酸变异位点,变异率为0~4.4%。进化分析结果显示,用GRA25基因不能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型虫株。生物信息学分析预测弓形虫GRA25蛋白含有7个亲水区域,10个α-螺旋,3个β-折叠,8个无规则卷曲和8个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。本研究结果表明,GRA25基因不能作为标记分子区分不同基因型的弓形虫虫株,但可能作为疫苗候选分子研制新型抗弓形虫基因疫苗或表位肽疫苗。     

弓形虫棒状蛋白17基因的克隆与序列分析

为研究弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)基因的遗传变异,本研究以弓形虫RH株、PRU株和TgC7株为研究对象,首次PCR扩增了其ROP17基因部分序列,将PCR产物纯化后克隆到pMD18-T并测序。将测定的序列与网上下载的弓形虫VEG株、GT1株和ME49株相应序列进行比对,然后用Mega 5.0程序的NJ法和Puzzle 5.2程序的ML法构建系统发育树。结果表明,3株弓形虫分离株的ROP17基因部分序列长度均为1375 bp,A+T含量在49.53%~50.04%之间,3个虫株相应序列的变异碱基数皆小于20个,其变异率为2.3%,氨基酸序列变异率在0~6.11%之间。系统发育结果显示, ROP17基因部分序列能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型的虫株。本研究结果为进一步研究弓形虫ROP17基因的变异及研制弓形虫ROP17基因的亚单位疫苗提供了理论依据。     

刚地弓形虫18S rDNA基因的克隆与序列分析

采用PCR方法从弓形虫RH株和CN株总DNA中分别扩增到18S rDNA基因，与pGEM-T easy vector连接，并进行DNA测序分析。结果表明，2个虫株均扩增出1745bp的片段，用DNAMAN软件对其与GenBank上2个虫株相应序列进行同源性比较，4个虫株的同源性为99．34％。刚地弓形虫虫株在不同宿主和不同区域上存在着一定的差异。     

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2（rh—potryprotein2）的部分基因，构建pGEX—KG—ROP2重组表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定后，将阳性质粒转入E．coli BL21CodonPlus中，在IPTG诱导下表达，表达产物用SDS—PAGE和Western—blot分析鉴定。结果表明，扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9％，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000，可被兔抗弓形虫免疫血清识别。     

奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。     

BMY牛MSTN基因exon 2克隆及序列分析

[目的]克隆BMY牛MSTN基因外显子2的序列,以期分析其遗传变异.[方法]通过对PCR产物进行克隆,比较哺乳动物MSTN基因外显子2之间的同源性,并构建其系统发育关系.[结果]通过PCR扩增,对PCR产物克隆得到BMY牛MSTN基因exon 2序列为372 bp编码124个氨基酸残基,牛亚科物种间的核苷酸同源性较高,在98.7％～100.0％之间,BMY牛、瘤牛、牦牛与大额牛079-gayal(Bos frontalis)的氨基酸序列一致,而日本和牛在第89位发生了天冬酰胺(Asn)→丝氨酸(Ser)的突变.构建的牛亚科几个物种之间的系统发育关系表明,含有瘤牛血统的BMY牛与瘤牛、牦牛的关系较近,且大额牛079-gayal与瘤牛的关系也近,推测大额牛在其形成历史中曾经受过瘤牛的基因渐渗.牛亚科物种的牦牛、大额牛、日本和牛、瘤牛与BMY牛聚为一支,而与水牛的关系较远.人与黑猩猩、猕猴聚为明显的一支.[结论]BMY牛MSTN基因外显子2长度为372 bp,系统聚类分析表明BMY牛含有瘤牛血统和典型的瘤牛特征.     

水牛FADS2基因的电子克隆及序列分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛Δ6脂肪酸脱氢酶（Δ6-fatty acid desaturases,FADS2）基因进行克隆和生物信息学分析,为探究FADS2基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛FADS2基因序列（GenBank登录号：NM_001083444.1）为探针设计引物,利用电子克隆法克隆水牛FADS2基因,并通过RT-PCR验证,对FADS2基因的序列特征进行生物信息学分析。测序结果表明,水牛FADS2基因序列全长为36 600 bp,由12个外显子和11个内含子组成,包含一个长1 335 bp的开放阅读框,可编码444个氨基酸。序列同源性分析显示,水牛FADS2基因编码序列与牦牛、黄牛、人、猪、家兔、虎鲸和褐家鼠序列的同源性分别为98.88%、98.88%、89.66%、90.79%、90.85%、92.35%和87.11%。蛋白质预测分析表明,水牛FADS2蛋白分子质量为52.51 ku,理论等电点（pI）为8.75,呈弱碱性,属于亲水性蛋白,无信号肽。系统进化树分析结果表明,FADS2基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,其中水牛与牦牛、黄牛亲缘关系较近,与褐家鼠亲缘关系较远。水牛FADS2基因的成功克隆为今后阐明水牛泌乳性能的作用机制奠定了基础。     

隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

根据藏系绵羊的ACSS2基因序列设计克隆引物,并以隆林山羊肌间脂肪组织为模板克隆ACSS2基因并测序。利用在线生物信息学软件分析ACSS2蛋白的序列特性,分析不同物种间ACSS2基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊ACSS2基因的功能。结果发现,隆林山羊ACSS2基因CDS全长2 103bp,由18个外显子组成,编码701个氨基酸残基。与牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)序列的ACSS2基因相比较,核苷酸相似性分别为97.9%、91.5%、97.6%和88.2%,氨基酸的相似度分别为98.4%、93.6%、97.4%和91.9%。其中绵羊较山羊多出13个氨基酸(G279-Q291,GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2蛋白与其他物种间具有相似的三级结构系统,且与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与猪的亲缘关系较远。     

Cloning and Sequence Analysis of Toxoplasma gondii GRA25 Gene

In this study,sequence variation of GRA25 genes among 22 Toxoplasma gondii (T.gondii) strains from different hosts and geographical locations were examined.The complete GRA25 genes from 22 T.gondii isolates were amplified,sequenced,and nucleotide variations were determined.Phylogenetic analysis among the different T.gondii isolates were conducted using maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML) methods.The biological characteristics of the protein GRA25 of the T.gondii RH strain were predicted using bioinformatics software.The sequences of all the examined T.gondii strains were 939 or 948 bp in length.Sequence comparison of all 22 GRA25 sequences identified 82 variable nucleotide positions (0 to 4.4%).The results of phylogenetic analysis showed that strains belonging to the classical typeⅠand Ⅱ could not group into their own branches based on the GRA25 sequences.Bioinformatics analysis revealed that the protein GRA25 contained 7 hydrophobicity regions,10 alpha regions,3 beta sheets,8 random coils and 8 linear B-cell epitopes.These results suggested that the GRA25 gene was not an ideal genetic marker for population genetic study of T.gondii strains,but it might represent a good vaccine candidate against toxoplasmosis.     

弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定.然后阳性重组质粒转化入E.coli BL21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定.结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列（AJ132530）的同源性达99.6 %,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别.说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础.     

弓形虫MORN2基因敲除株的构建及其表型鉴定

本研究旨在构建弓形虫（Toxoplasma gondii）Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2（membrane occupation and recognition nexus protein,MORN2）基因敲除株,探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物,以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板,在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒;在MORN2靶点两翼约500 bp设计同源臂引物,以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因（DHFR）的同源片段;将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中,进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示,试验成功获得MORN2基因敲除株,在体外噬斑试验中,该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致;在体内感染试验中,分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠,小鼠的死亡时间与对照组基本一致,说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能,为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。     

刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的克隆及序列分析

本研究根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,利用PCR方法从已鉴定为2型鸭疫里默氏菌RA-FJ株的基因组DNA中扩增目的基因片段,胶回收PCR扩增片段,克隆到pMD18-T载体后进行序列测定.采用生物信息学软件对测序结果进行分析,结果表明所获得的RaDtxR基因编码完整的开放阅读框,全基因长度为654 bp,编码217个氨基酸.所编码的蛋白大小为24.82 ku,理论等电点为5.69,不稳定系数为38.45,属于稳定蛋白质类.将其与GenBank中已发表的RaDtxR基因序列进行核苷酸同源性比对分析,结果显示其与鸭疫里默氏菌疫苗株RA-CH-1株(GenBank登录号:CP003787)的核苷酸同源性为100.0%,与其他4株核苷酸同源性均为99.8%,仅在186位处存在无义突变.利用该基因对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌进行扩增,结果显示均未扩增到条带,对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的1型、2型、3型、11型和13型鸭疫里默氏菌均可扩增出特异性目的条带,表明RaDtxR基因可作为鸭疫里默氏菌鉴别诊断的靶基因.试验结果表明,本研究成功克隆到鸭疫里默氏菌RaDtxR基因,为研究其功能奠定基础.     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在 IBRS-2细胞内的表达

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。