昆虫杆状病毒杀虫剂研究与应用综述

综述了对野生型昆虫杆状病毒和重组昆虫杆状病毒杀虫剂的研究进展,以及我国昆虫杆状病毒杀虫剂的应用研究现状。     

昆虫杆状病毒杀虫剂的研究与应用进展

昆虫杆状病毒由于寄主专一性强、与环境相容性好等特点而受到人们广泛关注,成为生物防治害虫的重要内容之一。本文介绍了野生型昆虫杆状病毒的筛选和开发,高效、安全的基因工程重组杆状病毒杀虫剂的研究与应用,并对重组病毒的安全性进行了客观的分析和评价,对病毒杀虫剂的发展前景进行了展望。     

昆虫杆状病毒分子生物学及其应用研究的新进展

杆状病毒是昆虫专一性的病原病毒,具有重要的应用价值。首先,杆状病毒是昆虫杆状病毒表达系统的核心部分,该系统已在药物研发、疫苗生产等方面得到广泛应用。随着杆状病毒载体的不断改进,杆状病毒表达系统获得重组病毒的几率已从最初的0.1%~1%提高到现在的80%~90%,并且出现了一些新的宿主域扩大的杆状病毒载体。其次,杆状病毒是非复制型载体,且能高效表达目的蛋白,目前杆状病毒作为基因转移载体在基因治疗中已显示出良好的应用前景。此外,杆状病毒还是一类重要的微生物杀虫剂。重组杆状病毒杀虫剂及其安全性也是目前人们关注的焦点。综述了杆状病毒分子生物学及其最新应用进展。     

杆状病毒杀虫剂增效途径研究进展

杆状病毒作为杀虫剂应用已成为生物防治中不可缺少的环节。但杆状病毒相对低的毒力和较长的杀虫时间是制约其推广应用的原因之一。本就如何提高杆状病毒的杀虫效果，从基因重组、增效蛋白及化学增效剂三个方面，对近年来的相关研究进行了概括，并对三种增效途径在研究和应用中存在和面临的问题提出了解决对策。     

杆状病毒的生态学和流行病学研究进展

杆状病毒作为杀虫剂应用,已成为生物防治中不可缺少的环节,也是一类重要的生物防治因子,但杆状病毒相对低的毒力和较长的杀虫时间是制约其推广应用的原因之一.文中就杆状病毒与宿主的关系,杆状病毒在环境中的存活、滞留与扩散等方面的流行病学研究进展做一总结.     

MicroRNA在杆状病毒侵染过程中的功能研究进展

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的非编码RNA,约22 nt,是基因表达的关键调节因子,参与生物体中一系列重要的生物学过程。大多数DNA病毒编码miRNA,包括杆状病毒。杆状病毒由双链环状DNA组成,能特异性感染鳞翅目、膜翅目和双翅目等昆虫,在农业害虫防治和生物学研究中广泛应用。介绍了miRNA的生物合成和作用机制,并综述了杆状病毒感染宿主后病毒和昆虫宿主编码的miRNA以及其在杆状病毒侵染过程中的功能,为杆状病毒杀虫剂的研发和应用提供理论依据。     

昆虫杆状病毒基因组学研究进展

杆状病毒(Baculoviruses)是一类在自然界中专一性感染节肢动物的共价闭合双链环状DNA病原微生物。由于杆状病毒的宿主特异性高,其作为无公害生物杀虫剂在生物防治方面发挥重大作用。此外,杆状病毒已被开发成为高效的真核表达载体,广泛应用于药物研发、疫苗生产等领域,并作为基因治疗载体用于疾病的基因治疗。综述了获得全基因组序列的昆虫杆状病毒类别及其序列特征,以及昆虫杆状病毒基因组中的主要功能基因,包括RNA转录相关基因、DNA复制相关基因、结构蛋白基因等,也对其应用做了较为详尽的阐述。     

粘虫核型多角体病毒(LsNPV)部分基因文库构建及Xho Ⅰ-X片段的末端序列测定

杆状病毒作为生物杀虫剂具有安全、持效、不易产生抗药性等优点，而杆状病毒－昆虫细胞表达系统具有产量高、易控制、相对安全等优点，目前已有数百种外源蛋白在杆状病毒－昆虫细胞系统中表达。国外已报道了苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）１３１．９ｋｂ［１］、...     

小菜蛾颗粒体病毒杀虫剂研究与应用进展

小菜蛾颗粒体病毒（ Plutella xylostella granulovirus, PxGV）隶属杆状病毒科颗粒体病毒属,对小菜蛾具有较强的致病和杀灭作用,可以加工成环保安全的生物杀虫剂,用于防治小菜蛾。从病毒生物杀虫剂应用的角度,综述了PxGV的应用进展及影响其稳定性的主要因素,包括温湿度、pH值和紫外线等,并对其发展前景进行了展望。     

苏云金杆菌和昆虫杆状病毒增效因子的研究进展

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）、昆虫杆状病毒作为杀虫剂是害虫生物防治中不可缺少的重要组成部分.文章就如何提高该两种杀虫剂的杀虫效果,从两种生物农药间的混合应用、与化学农药的混合应用、在生物农药中添加其它增效因子3个方面,对近年来的研究进展进行了综述,并对研究和应用中存在的问题提出了解决对策.     

鹅源新城疫病毒HN基因在Bac to Bac系统中的表达及抗原性检测

血凝素-神经氨酸酶蛋白(Haemagglutinin Neuramindase,HN)是鹅源新城疫病毒诱导体液免疫的重要靶抗原。经pMD18-T-HN阳性质粒扩增了HN基因,扩增的片段亚克隆到转座载体pFastHTb中构建重组转座载体pFastHTb-HN。将其转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组杆粒rBacmid-HN,重组杆粒rBacmid-HN转染sf9昆虫细胞,收获的重组病毒盲传两代。PCR鉴定重组病毒,获得的重组杆状病毒命名为rBv-HN。经间接免疫荧光(IFA)和SDS-PAGE鉴定,获得的重组杆状病毒rBv-HN在sf9昆虫细胞中获得表达,且表达的蛋白大小为75ku左右,与理论值相当。Western blot和Dot-ELISA检测结果表明,表达的蛋白可与鸡抗NDV血清发生特异性抗原反应,证实所表达的蛋白具有良好的反应原性。     

表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.     

表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

新城疫病毒F和HN核心片段在杆状病毒中的表达

为研制抗新城疫病毒的基因工程疫苗,将新城疫病毒F48E8株F和HN基因的核心片段克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,然后转化到DH10Bac感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组,最后将重组子转染TN5细胞,得到含F片段和含F HN片段的重组杆状病毒rBac F和rBac F HN。PCR扩增结果证实F和F HN基因片段重组到杆状病毒基因组中;SDS-PAGE和Western blot检验结果表明F和F HN基因片段在重组病毒中得到了表达。     

表达鸡传染性支气管病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白.     

表达PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒对小鼠的保护力试验

PCR扩增猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白(Capsid)基因,鉴定后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastBac-Cap,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经转座作用,蓝白菌落筛选得到含cap基因的重组穿梭载体Bacmid-Cap,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒reBacCap,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使reBac-Cap感染的Sf9昆虫细胞出现特异性绿色荧光,表明reBac-Cap在Sf9细胞中成功表达PCV2-Cap蛋白.动物试验表明该重组病毒对小鼠有一定的保护力.     

水稻瘤矮病毒S3和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,...     

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测

首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。     

水稻瘤矮病毒髓和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）主要内层衣壳蛋白53基因和外层衣壳蛋白鼹基因的重组杆状病毒,将目的基因（S3和S8）分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子（PH）和plO启动子的下游．经酶切和确证性序列测定,将其转化到DHl0Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpF-BDS3-58转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Si9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒．结果表明：SD昆虫细胞被侵染72h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物质,部分细胞破裂甚至裂解,说明53和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中,这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础．