兔IL-6基因真核表达载体的构建及其对pcDNA-VP60DNA疫苗佐剂效应研究

为研究兔白介素6（interleukin6,IL-6）真核表达质粒（pcDNA-IL-6）对核酸疫苗免疫效果的影响,本文构建了真核表达质粒pcDNA-IL-6,并将其与核酸疫苗pcDNA-VP60联合免疫家兔,以pcDNA-VP60和质粒载体pcDNA3．1（＋）作对照,用血凝抑制试验检测试验兔体内特异性抗体水平。结果表明：真核重组质粒pcDNA-IL-6对重组质粒pcDNA-VP60均具有免疫增强作用,从免疫后7d到70d,pcDNA-VP60／pcDNA-IL6联合免疫组抗体水平均高于pcDNA-VP60免疫组,差异具有显著统计学意义。     

兔瘟病毒VP60基因重组真核表达质粒的构建及其免疫原性

采用RT-PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体,获得重组质粒pMD19-T-VP60,并进行序列测定。测序正确的pMD19-T-VP60经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切后,将目的片段VP60插入真核表达载体pVAX-1,构建真核表达质粒pVAX1-VP60。将构建好的重组质粒pVAX1-VP60按500μg/只腿部肌肉注射25日龄家兔,同时设pVAX-1组、兔瘟组织灭活苗组和PBS组。分别于免疫后7,14,21,28,35,42 d对各组兔静脉采血,间接ELISA法检测血清中特异性抗体水平,结果显示PBS组和pVAX-1组未检测到特异性抗体,pVAX1-VP60组和兔瘟组织灭活苗组家兔都能产生高水平的特异性抗体,在特异性抗体水平高峰期,2组数据差异不显著(P0.05)。于免疫后3,7,14,21,28,35,42 d随机剖杀pVAX1-VP60组试验兔3只,取心、肝、脾、肺、肾、腿部肌肉,提取组织DNA,进行PCR检测,结果均检测到目的基因VP60的存在。免疫后28 d以滴度10~8的RHDV 0.5 m L/只腿部肌肉注射攻毒,pVAX-1组、PBS组、兔瘟组织灭活苗组、pVAX1-VP60组的相对保护率分别为0%,0%,90%,85%,表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。     

猪繁殖与呼吸综合征DNA重组质粒对猪的免疫效应

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗、表达GP5蛋白的DNA重组质粒分别与表达IL-2和IL-4的重组质粒(pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4)联合免疫健康仔猪,经3次免疫后人工感染PRRSV HB-2株,检测仔猪体液免疫以及攻毒保护性反应。研究结果显示,重组质粒pCI-GP5可诱导免疫猪产生抗GP5抗体,最高ELISA抗体效价可达1∶285。攻毒后组织中PRRSV核酸的检出率下降30.3%,与对照组相比,差异显著(P<0.05),表明表达PRRSV GP5的DNA重组质粒pCI-GP5可诱导一定的免疫效力。pcDNA-IL-2与pCI-GP5联合免疫后,病毒血症的出现频率减少38.9%,PRRSV阳性组织检出率下降28.8%,与对照组差异显著(P<0.05);pcDNA-IL-4与pCI-GP5联合免疫后,最高ELISA抗体效价可达1∶320,病毒血症的出现频率下降38.9%,PRRSV阳性组织检出率减少34.8%,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。本研究表明,PRRS DNA重组质粒pCI-GP5对猪的免疫保护力是稳定的,真核表达的细胞因子pcDNA-IL-2与pcDNA-IL-4能够显著增强pCI-GP5的免疫保护力。     

兔瘟蜂胶组织灭活苗的研制及免疫效果观察

采用人工感染兔瘟(兔病毒性出血症)病毒致死的兔的脏器(主要是肝)，制成10％的兔瘟组织灭活苗和10％的兔瘟蜂胶组织灭活苗。采用常规血凝抑制实验，初步分析比较了注射兔瘟组织灭活苗和兔瘟蜂胶组织灭活苗后兔体内抗体水平的消长情况。结果表明：兔瘟蜂胶组织灭活苗能明显提高抗体效价，增强免疫效果。     

兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究

为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。     

兔瘟抗体检测卡的研究及应用

正兔病毒性出血症又名兔瘟,是兔的一种急性、致死性的病症,具有高度接触性,以实质器官水肿、淤血和出血性变化为特征。针对本病危害严重,都用兔病毒性出血症组织灭活苗,对家兔进行免疫接种,但是,疫苗免疫后还有大量养殖场发生兔瘟,造成很大的经济损失。为此我们设想,有没有一种简便的检测兔瘟抗体的方法,一般实验室血凝检测方法在养殖户条件下操作性低,难以保证兔子兔瘟抗体的水平和防疫的有效性。笔者开展了兔     

新剂型兔瘟疫苗的研究

经血凝抑制和攻毒试验结果表明，在含有相同抗原量制备的疫苗，兔瘟油乳剂灭活疫苗比兔瘟组织灭活苗免疫后血清ＨＩ抗体效价高３．２５￣６．０ｌｏｇ２，即使油乳剂灭活疫苗仅为组织灭活苗四分之一的抗原量，免疫后血清ＨＩ抗体效价还高１ｌｏｇ２。油乳剂灭活苗免疫兔第５０天其血清ＨＩ抗体未见下降，而组织灭活苗免疫后第２６天已开始下降。虽然接种二种剂型的疫苗攻毒后均具有１００％的保护率，但血清ＨＩ抗体效价消长情况证明     

兔瘟氢氧化铝佐剂苗与常规灭活苗的比较

将兔瘟氧氧化铝佐剂苗与常规组织灭活苗作对比试验，结果表明：在ＨＩ抗体水平上，佐剂勒产生的抗体峰值极显著地高于常规苗；佐剂苗的免疫期可达１２个月，而常规苗为８个月；在保存期方面，佐剂苗在室温存放一年仍保持良好的免疫效果。     

兔瘟氢氧化铝佐剂苗与常规灭活苗的比较

将兔瘟氢氧化铝佐剂苗（简称佐剂苗）与常规组织灭活苗（简称常规苗）作对比试验，结果表明：在ＨＩ抗体水平上，佐剂苗产生的抗体峰值极显著地高于常规苗；佐剂苗的免疫期可达１２个月，而常规苗为８个月；在保存期方面，佐剂苗在室温存放一年仍保持良好的免疫效果     

兔瘟免疫失败原因及防制措施

在家兔生产过程中,尽管家兔已接种了兔瘟疫苗,但在规定的免疫期内仍发生兔瘟或抗体监测时达不到应有的抗体水平,甚至有发生整个兔群暴发兔瘟的情况.那么为什么会发生免疫失败?笔者在多年的生产实践过程中进行了深入调查,对家兔免疫失败的原因进行了分析和总结,并提出了相应的对策.     

鲤IL-10锦鲤疱疹病毒核酸疫苗联合免疫效果的研究

本研究选用鲤IL-10,构建p EGFP-N1-IL-10真核表达质粒,分别进行体外细胞转染试验和免疫鱼的试验,证明了重组质粒在细胞中能成功表达,体内免疫试验ELISA结果显示,抗体水平会随着免疫次数、剂量的增加逐渐升高,三免后第1周的抗体水平最高,随后抗体水平逐渐下降。相比单一核酸疫苗p IRES-ORF81,p EGFP-N1-IL-10与核酸疫苗p IRES-ORF81联合免疫所产生抗体水平明显升高,但差异不显著(P>0.05)。     

兔出血症-巴氏杆菌病二联灭活苗的研制

本试验筛选出了具有良好免疫原性的兔瘟强毒株GMH881和兔巴氏杆菌C51-17株,研制出了兔出血症-巴氏杆菌二联灭活苗。确定出二联苗免疫剂量为1.0mL;二联苗在免疫后5d对兔病毒性出血症强毒的保护率达到100%,二联苗免疫后7d对兔巴氏杆菌的保护率均达到80%以上;二联苗免疫家兔后7d兔病毒性出血症HI抗体可达22.75,15d明显上升,二联苗HI效价30d达到最高峰,可达28.0,二联苗在60～120d均可维持在27.0～25.5水平,到180d时抗体水平略有下降,为25.25,二联苗分别在免疫后4个月、6个月用兔出血症强毒攻击,均产生100%保护,在6个月用2个MLD的兔巴氏杆菌攻击,保护率可达70%以上;二联苗4~8℃条件下保存期暂定为1年,25℃条件下暂定为半年。     

兔出血症-巴氏杆菌病二联灭活苗的研制

筛选出了具有良好免疫原性的兔瘟强毒株GMH881和兔巴氏杆菌C51-17株,研制出了兔出血症-巴氏杆菌二联灭活苗,对疫苗进行了免疫剂量、免疫产生期、兔出血症抗体测定、免疫保护期、保存期等试验：确定出二联苗免疫剂量1.0 mL;二联苗在免疫后5 d对兔病毒性出血症强毒的保护率达到100%,二联苗免疫后7d对兔巴氏杆菌的保护率均达到80%以上;二联苗的兔病毒性出血症抗体测定,结果表明,二联苗免疫家兔后7d HI抗体均可达22.75,15 d明显上升,二联苗HI效价30 d达到最高峰,可达28.0,二联苗在60~120 d均可维持在27.0~25.5水平,到180 d时抗体水平面略有下降为25.25,二联苗分别在免疫后4个月、6个月用兔出血症强毒攻击均产生100%保护,在6个月用2个MLD的兔巴氏杆菌攻击保护率可达70%以上,二联苗4~8℃条件下保存期暂定为1年,25℃条件下暂定为半年。     

兔出血症-巴氏杆菌病铝胶二联灭活苗的研制

筛选了具有良好免疫原性的兔瘟强毒株GMH881和兔巴氏杆菌C51-17株,研制出了兔出血症-巴氏杆菌二联铝胶灭活苗,对疫苗进行了免疫剂量、免疫产生期、兔出血症抗体测定、免疫保护期、保存期等试验;确定出二联铝胶苗免疫剂量1.0 mL;二联铝胶苗在免疫后7 d对兔病毒性出血症强毒的保护率达到100%,二联苗免疫后10～14 d对兔巴氏杆菌的保护率均达到75%以上;二联铝胶苗的兔病毒出血症抗体测定结果表明：二联铝胶苗免疫家兔后7 d,HI抗体均可达25.0,15 d明显上升,二联苗HI效价60～90 d达到最高峰,最高可达210,二联苗在120～180 d仍可维持在27.0～29.5水平。二联铝胶苗分别在免疫后4个月、6个月用兔出血症强毒攻击均产生100%保护,在6个月用2个MLD的兔巴氏杆菌攻击保护率可达70%以上,二联铝胶苗4～8℃条件下保护期暂定为1年,25℃条件下暂定为半年。     

兔出血症-巴氏杆菌病铝胶二联灭活苗研制及免疫效果的观察

采用对本地区具有良好免疫原性的兔病毒性出血症强毒株和巴氏杆菌菌株,研制出常规二联灭活苗和铝胶二联灭活苗,用血清学方法对常规二联灭活苗和铝胶二联灭活苗免疫后兔病毒性出血症抗体的检测.结果表明,铝胶二联苗免疫家兔7 d HI抗体可达25,15 d明显上升,25.5,60～90 d达到最高峰,最高可达210,120～180d...     

抗兔瘟精制卵黄抗体的研制

选用免疫原性好的兔瘟抗原加工成浓缩兔瘟灭活组织疫苗,按特定的免疫程序接种健康商品鸡群,通过血凝抑制试验检测免疫鸡群血清和卵黄的兔瘟抗体效价,适时收集高免卵黄,选用特定的抗体分离提纯工艺,研制对兔瘟有预防和治疗双重作用的精制卵黄抗体。经实验室生物学检验,本品使用无刺激,作用迅速,对兔瘟早期治愈率为80%,对兔瘟紧急预防有效率为100%。     

携带兔斯氏艾美耳球虫MIC-5基因减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

对携带兔斯氏艾美耳球虫微线蛋白-5基因(MIC-5)真核表达质粒asd-pBMIC-5-IL-15的减毒鼠伤寒沙门菌X4550(X4550/asd-pBMIC-5-IL-15)进行了安全性、稳定性与免疫原性试验.结果显示,重组菌在109CFU剂量以下对家兔安全;连续培养30代重组菌,重组表达质粒可稳定存在于X4550内,具有良好的遗传稳定性;用重组菌2次免疫动物后,既能诱导机体产生抗兔斯氏艾美耳球虫抗体,也能显著增强淋巴细胞增殖水平,抗球虫指数为164.4.试验表明,减毒沙门菌介导的兔球虫调节型DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性.     

免疫兔暴发兔瘟病的诊断

兔瘟是一种急性、烈性、病毒性传染病,3月龄以上的家兔发病率、死亡率高达95%以上。应用兔瘟灭活疫苗能有效地防制本病的发生和流行。现报道一起使用失效兔瘟灭活苗免疫兔群发生兔瘟病病例。1发病情况盱眙黄花塘某村养兔户杜某,饲养毛兔206只,其中青年兔126只,成年兔80只。2005     

用DNA免疫研制鸡白细胞介素2单克隆抗体

构建鸡白细胞介素2(鸡IL-2)的真核重组质粒pcDNA-IL-2和原核重组质粒pET-IL-2,以重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组质粒pET-IL-2在大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达的蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后共获得3株针对鸡IL-2的特异性单克隆抗体,并对这3株单克隆抗体的特性进行了鉴定。     

非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法，试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白，将其纯化后免疫小鼠，获得阳性杂交瘤细胞，通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株，并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化，初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法，并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠，抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞，将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核...