滞育诱导发生温度与光周期对家蚕垂体同源框激素基因Pitx表达的影响

家蚕垂体同源框激素PITX对滞育激素DH的分泌与作用有直接影响。为了探讨家蚕滞育的信号传导机制,研究了3种典型的滞育发生诱导温度和光周期条件对Pitx基因表达的影响。结果显示,亲代催青期滞育卵诱导发生条件25LL显著上调了蚕卵中Pitx基因表达水平。整个世代持续25LL环境中,3龄前幼虫和成虫体内,Pitx基因的表达水平高于15DD环境中的蚕体;胚后蚕体Pitx基因的表达水平有显著组织差异,幼虫眠中表达水平有下调趋势。子代卵内Pitx基因mRNA的水平变化与亲代诱导所致的蚕卵滞育性差异密切相关,滞育性卵中未检测到母源Pitx基因的mRNA,卵龄12～24h的胚胎发生期则有较高水平的表达,卵龄72h后的滞育发生阶段后只有痕迹量;非滞育性卵中有较高水平的母源Pitx基因mRNA,胚胎发生及发育期,Pitx基因转录水平显著高于滞育性卵;亲代20LD催青条件下所产卵滞育性不稳定,Pitx基因的mRNA水平显著高于滞育性卵,也高于非滞育性卵。亲代卵的孵化温度与光周期决定子代卵的滞育性,也影响到Pitx基因表达水平,子代卵内Pitx基因表达水平高低不是蚕卵滞育与否的关键。     

滞育诱导发生温度与光周期对家蚕羽化激素基因表达的影响

羽化激素(EH)是调控生长发育的重要神经肽激素。本文研究了家蚕滞育发生诱导温度和光周期条件对羽化激素基因(Eh)表达的影响。结果显示,在15DD非滞育卵诱发环境下,催青期胚胎的Eh基因mRNA一直处于很低水平;而在25LL滞育卵诱发环境或20LD滞育卵与非滞育卵同时出现的诱发条件下,能够检测到Eh的高水平表达,提示胚胎期可能已经开始合成EH。其中25LL蚕卵Eh基因的表达水平高于20LD区,并在积温高于1 440℃.h(反转期)后,Eh基因表达水平显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光照节律更加敏感相一致。在胚后幼虫至成虫期维持催青期的15DD或25LL环境中,1-4龄幼虫在食桑期Eh基因继续了胚胎后期25LL中高表达的现象,但5龄幼虫至成虫期出现15DD环境Eh基因表达水平显著高于25LL区的现象。胚后改用25℃自然光照环境保护,25LL区的子代滞育性卵和15DD区的子代非滞育性卵中,表现出15DD环境Eh基因表达水平高于25LL区的现象,在卵龄48h后更加明显。结果表明亲代卵的孵化温度与光周期在决定子代卵的滞育性同时,显著影响整个世代Eh基因的表达。     

诱导滞育的温度和光照节律对家蚕滞育激素基因Dh表达的影响

滞育激素(DH)是导致家蚕滞育生理现象出现的关键因素。研究卵期不同温度和光照节律引起家蚕滞育激素基因Dh表达的变化,探讨温度和光照对家蚕滞育调控的机制。催青期25℃持续光照(25LL)条件下,蚕卵中Dh基因mRNA高水平稳定转录;而在15℃持续黑暗(15DD)条件下,蚕卵中只有痕迹量Dh基因mRNA存在;25LL或者20℃、光照与黑暗12h交替(20LD)条件下,胚胎发育至单眼着色后(有效积温2160℃.h以后)Dh基因mRNA转录水平显著上调,与此时期胚胎对诱导滞育的温度和光照节律更加敏感一致。从催青期开始整个世代的保护温度和光照节律,呈现高温25℃显著上调整个胚后时期Dh基因mRNA转录水平,光照上调蛹期与蛾期Dh基因mRNA转录水平,且高温的作用强于光照。5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,Dh基因mRNA转录水平存在显著的性别与组织差异,雌蚕多个组织中的Dh基因mRNA转录水平都显著低于雄蚕,卵巢中的Dh基因mRNA只有痕迹量。亲代卵的催青温度与光照节律决定子代卵的滞育性,也影响到Dh基因mRNA的转录水平;但子代卵内Dh基因mRNA转录水平高低不是蚕卵滞育与否的关键。推测家蚕Dh基因表达的性别差异及在早期蚕卵中表达特征与滞育性不一致的现象,可能与Dh基因的前体多肽翻译产物剪切有关。     

滞育诱导温度和光照节律对家蚕sod基因和cat基因的表达的影响

家蚕(Bombyxmori)是卵滞育性鳞翅目模式昆虫,其滞育性受亲代卵孵化期(催青期)温度、光节律等环境因子诱导。为了研究家蚕滞育与温度和光照节律的关系,本文调查了温度、光照节律对家蚕sod基因和cat基因表达的影响。催青期中除了孵化期,25℃持续光照下(25LL)卵的sodmRNA均保持在较高水平,另外,sod基因在20℃光照黑暗(20LD)12h交替环境下的表达量要高于15℃持续黑暗(15DD)条件,且孵化后期这种现象更加明显。cat基因在25LL、20LD和15DD环境之间的表达量无差异,但是孵化后期(积温2160-3600℃.h),cat基因表达水平显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光节律比较敏感的结论相一致。此外,本文还调查了子代卵中sod基因和cat基因的表达情况。sod基因在人工活化卵(DTE)中的表达水平显著高于非浸酸的滞育性卵(DDE);卵龄24-192h,25LL子代卵逐渐进入滞育,sod基因表达量下调。低温黑暗条件会上调家蚕子代卵sod基因的表达水平。在初期的盐酸活化卵(DTE)中,cat表达量低于滞育卵(DDE),而后逐渐上升,直至接近滞育卵表达量,这表明盐酸可能会抑制cat基因表达。在恒温条件下,黑暗条件会促进子代卵上调cat表达。在温度光照协同作用下,20LD子代卵中cat表达量低于25LL和15DD。     

滞育诱导温度与光照对家蚕近日节律基因per表达的影响

温度和光照是昆虫近日节律基因表达的授时因子,也是影响家蚕滞育的决定因素。为了解家蚕滞育与近日节律调控的关系,研究了滞育诱导发生温度与光照对家蚕近日节律基因per表达的影响。家蚕整个世代在25℃高温环境下,或幼虫期与蛹期在20℃的较高温度下,per基因在黑暗环境中的转录水平高于光照环境。家蚕幼虫及蛹期在相同光照条件下,per基因转录水平在高温环境中高于低温环境,黑暗环境下又呈现20℃25℃15℃的变化趋势,且温度的影响大于黑暗环境;在25℃持续光照条件(25LL)下,胚后时期per基因的表达水平高于15℃持续黑暗的条件(15DD),而20℃及光照与黑暗各12 h条件(20LD)下变化更加敏感,这与温度和光照对家蚕滞育的诱导作用一致。在处女蛾和卵产出后0.5 h的未受精蚕卵中都检测到了高水平的母源per基因mRNA。亲代卵催青期的单因子25℃高温或黑暗、以及20LD,都会引起子代卵内per基因mRNA水平的上调,这种上调只出现在滞育出现或活化发育的转折时间点(卵龄72 h)之前。家蚕滞育诱导温度和光照条件直接影响per基因在整个世代的差异表达,该基因在卵期的表达与胚胎滞育性差异密切关联。     

催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征

家蚕二化性品种的卵滞育与否受上代环境影响,25℃高温明催青将产滞育卵,而15℃低温暗催青将产非滞育卵。为探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,对从家蚕卵巢细胞中克隆的家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的5种cDNA进行生物信息学分析,结果表明Bmdhr基因的5种cDNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mR-NA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,Bmdhr mRNA-4编码的氨基酸序列与家蚕滞育激素BmDHR-1的序列相似度达99.2%。将家蚕二化性品种秋丰的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR分析催青温度对家蚕不同发育时期及蚕体组织中Bmdhr基因mRNA转录的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青的转录水平高于低温催青;Bm-dhr mRNA-4主要在各发育时期的蚕体血液中表达,特别是在高温明催青条件下,其在蛹期血液中的转录水平是低温暗催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种卵滞育与否的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2～3 d的卵巢中转录水平高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平开始下降,至化蛹后4～5 d 2种催青处理间的转录水平无显著差异。研究结果为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。     

家蚕滞育分子机制的研究

简述了有关家蚕滞育机制的分子生物学研究进展。家蚕的胚胎滞育是由环境条件和遗传性支配的。二化性蚕品种在胚胎中期和晚期经受高温和长光照 ,其结果是下一代胚胎滞育。不同的环境信息被神经分泌细胞“解读”和“受纳”。在特定的环境条件信息下 ,神经分泌细胞产生和分泌滞育激素 (DH)。滞育激素进入卵内 ,调节和建立滞育卵专一的内部环境。其特征是 ,滞育卵中发生有关糖原和山梨醇转换的一系列酶促反应 ,从而实现进入滞育、解除滞育等生理过程。     

家蚕滞育激素基因的克隆及在多化性和二化性品种间的表达差异

在之前的试验中给家蚕多化性品种马富(MF)的蛹体注射滞育激素仍无法诱导其产下滞育卵,为探究其原因,从该品种5龄第3天幼虫头部组织克隆了滞育激素基因(Bm DH)的全长c DNA,BLAST比对显示该基因编码氨基酸序列与NCBI数据库中来自家蚕二化性品种大造的Bm DH氨基酸序列(Gen Bank登录号:BAA059713)的相似度为90.1%,但存在差异的序列不包含滞育激素作用的功能区域。运用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR技术检测Bm DH基因在3个不同化性家蚕品种蛹期头部和卵巢的转录水平存在差异,转录水平从高到低依次为二化性家蚕品种C108,多化性品种MF、尼斯塔里;Bm DH在多化性家蚕品种MF的5龄期雌性和雄性幼虫的头部、血液、生殖腺3个组织中有转录,在中肠、丝腺、马氏管、表皮、脂肪体5个组织中没有检测到转录。研究结果初步提示:家蚕无滞育现象可能与体内滞育激素不足有关;但多化性品种MF不能被蛹期体外注射滞育激素诱导产生滞育卵与Bm DH基因的转录表达水平并无直接的关系。     

家蚕滞育生理及其分子调控机制研究进展

滞育是昆虫等动物应对周期性不利环境表现出的一种发育停滞的生理过程。家蚕既是重要的经济昆虫,也是鳞翅目模式生物,研究家蚕滞育生理及分子调控机制,对于理解昆虫的发育生理与适应性进化以及制定农林害虫防治策略等都有重要的理论和实践意义。国内外学者的研究证实,家蚕滞育是环境因素与遗传因素共同作用的结果,当环境信号被蚕体感知后转化形成滞育信号,再经复杂的信号转导途径,通过激素调节和营养物质储备与代谢的调控,使家蚕体内建立起适应滞育的生理代谢体系。近年来的研究进一步表明,家蚕滞育激素受体蛋白、热休克蛋白以及磷酸化作用参与的基因表达调控是家蚕滞育重要的分子调控机制,与滞育的起始、维持、终止密切相关。本文系统概述了上述家蚕滞育生理机制与分子调控机制的研究成果。     

家蚕卵滞育过程中的生理代谢

家蚕属完全变态昆虫,一个世代中要经过卵、幼虫、蛹、成虫四个在形态和生理上完全不同的发育时期.家蚕滞育发生在卵期,在自然条件下,一化性蚕通常在6月中下旬产卵,卵产下后不久便进人滞育,到翌春才能孵化,因此,一年中只能饲养一次蚕;多化性蚕没有滞育期,一个世代完成之后,产下非滞育卵,胚子继续发育,在25℃条件下,大约经过10天左右     

家蚕滞育激素受体基因(BmDHR)的分子克隆及定量分析

家蚕滞育激素受体(BmDHR)能特异性地识别滞育激素(DH),参与滞育激素信号的转导,在家蚕滞育发动过程中发挥重要作用。采用RT-PCR方法克隆出BmDHRcDNA,其开放阅读框长1 311 bp,编码436个氨基酸,属于一种G蛋白偶联受体,含有7个跨膜结构域。同源性及系统进化分析表明,BmDHR蛋白序列与玉米夜蛾性信息素合成激活肽受体(HzPBANR)和家蚕性信息素合成激活肽受体(BmPBANR)蛋白序列具有较高的同源性,分别为46.0%和40.9%。定时半定量分析显示,BmDHR基因表达水平在不同条件催青的二化性5龄幼虫、蛹体中存在差异。     

诱发滞育的温度和光照条件对家蚕胚胎生物钟信号主要基因表达的影响

为了深入研究温度和光照等昼夜节律授时因子对家蚕滞育的调控机制,以常规诱导滞育发生的温度与光照条件处理胚胎发育后期蚕卵,调查家蚕胚胎生物钟信号环路主要基因Cry1、Cry2、Per和Tim的表达对授时因子振荡变化的响应。结果显示:光照能够上调Cry1基因在家蚕胚胎发育后期的表达,温度则可改变该基因表达的振荡周期相位;温度在改变Cry2基因振荡表达相位的同时,低温(15℃)还能上调该基因在家蚕胚胎发育后期的表达;温度升高可缩短Per基因表达的振荡周期;黑暗诱导Tim基因振荡表达,温度则能够改变Tim基因表达的振荡周期相位。结果提示:家蚕胚胎中可能存在与其他昆虫类似的以CRY1为光感受器因子的生物钟信号环路,Cry1、Cry2、Per和Tim是家蚕胚胎期能够响应昼夜节律授时因子光照和温度而诱导滞育发生的生物钟基因。     

家蚕山梨醇脱氢酶基因的转录水平特性分析

为了探究家蚕山梨醇脱氢酶基因（BmSDH）在家蚕各发育时期和组织的转录水平,根据家蚕二化性品种子代滞育性受亲代胚胎期催青条件调控的原理,利用半定量RT-PCR分析25.0℃常温明催青和17.5℃低温暗催青对家蚕品种“秋丰”各发育时期蚕体和组织中BmSDH转录水平的影响.结果显示,BmSDH-1、BmSDH-2a和BmS-DH-2b在家蚕的各个发育阶段均有表达：在幼虫期5龄3d,BmSDH-1在常温明催青组脂肪体中转录水平较高;BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下的血液、脂肪体和卵巢中转录水平均高于低温暗催青;在蛹期3d,BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下血液和卵巢中的转录水平均低于低温暗催青;在次代卵产下后6～24h期间,BmSDH-2a和BmSDH-2b的转录水平逐渐升高.因此,BmSDH-1和蚕卵滞育与否没有直接关系,而BmSDH-2a和BmSDH-2b与家蚕二化性品种卵滞育与否有重要的平行关系,为从分子水平阐明家蚕滞育的分子机制积累了试验数据.     

家蚕无滞育期多化性品种的高效益省力化保育技术研究

家蚕品种资源是遗传育种的重要原始材料,为了减少每年对多化性家蚕品种的保育代数,减少劳动强度与保育成本,探讨了滞育激素对多化性品种蚕蛹的影响,试验结果表明：对无滞育期多化性蚕品种的蚕蛹注射微量滞育激素（DH）,可以使蚕蛾产下滞育卵,翌年解除滞育后,恢复无滞育期多化性状,且主要形态特征和经济性状都保持不变.滞育激素最佳注射时期为化蛹后24～ 86 h,蚕蛹注射DH的最佳剂量为2.0μg/个.使用这种方法,可以减少2～3个世代的人工饲料饲育,为无滞育期多化性蚕品种的保存提供了安全有效、省时省力的方法.     

合成滞育激素对家蚕卵Gpase、NAD-SDH、PFK、FBP活性的影响

二化性蚕品种大造在高温（25℃）明条件（每日光照18小时）下催青时,全部产滞育卵,在低温（16℃）暗条件（全天黑暗）下催青时全部产非滞育卵。低温暗条件下催青的大造在化蛹第3日注射一定剂量的合成滞育激素,可以诱导其产下70％左右左右的滞育卵。这种由合成滞育激素诱导形成的滞育卵,在滞育期中Gpase,PFK,FBP,NAD-SDH等与碳水化合物代谢相关的酶活性与非滞育卵不同,,但与天然滞育卵相似。只是酶活性和蚕卵解除滞育的时间比天然滞育卵有所提高。     

合成滞育激素 蚕卵碳水化合物代谢的影响

为了进一步阐明家蚕滞育激素在诱导滞育卵发生以及对蚕卵滞育过程中碳水化合物代谢的调节作用，对低温（16℃）暗催青的二化性品种大造，在化蛹初期注射合成滞育激素，诱导其产下滞育卵，然后将这种滞育卵分别用25℃和5℃保护，调查其在滞育过程中糖元、海藻糖、山梨醇和甘油量的变化。结果发现，从化蛹第3天开始，每天注射150pmol/合成滞育激素，连续3次，可得到70％左右的滞育卵。这种滞育卵在产卵初期糖元的含量与自然滞育卵相似，但山梨醇的含量仅有自然滞育卵的50％左右。诱导滞育卵在5℃中保护时，解除滞育的时间比自然滞育卵提前，孵化率比自然滞育卵低20％左右。未孵化卵大多在转青期死亡。由上述结果推测，这种诱导滞育卵在产卵初期糖元与山梨醇的代谢间存在某种障碍，从而影响山梨醇的合成，导致滞育的提前解除和胚胎发育异常。     

家蚕滞育机理研究进展

滞育是昆虫适应环境的重要生理特性,家蚕的滞育还与其经济性状有着密切关系,相关生物学问题一直是研究热点。家蚕滞育发生于胚胎早期,为卵滞育型,受遗传和环境的共同支配。家蚕二化性品系卵的滞育性由亲代卵期即胚胎发育时期所处的环境条件决定。本文就近年对家蚕滞育及解除过程中生理生化机制、分子机制和遗传机制方面的有关研究进展进行了综述,包括滞育过程中涉及的色素、酯酶A4、多巴胺、氧化循环过程的物质变化,二甲亚砜对解除家蚕滞育的影响以及滞育激素作用过程中瞬时受体电位通道亚家族成员对家蚕滞育非遗传多型性的分子调控机制的最新研究成果。     

家蚕、野桑蚕海藻糖酶基因启动子的特性及其滞育激素的转录调节

以pGEM 3Z为载体 ,分别构建了家蚕 (Bombyxmori)和野桑蚕 (Bombyxmandarina)海藻糖酶基因启动子控制的荧光素酶基因报告质粒 ,利用昆虫细胞瞬时表达系统进行启动子特性分析 ,并就家蚕滞育激素对海藻糖酶基因启动子转录活性的调节作用进行了研究。结果表明 :家蚕和野桑蚕海藻糖酶基因启动子在家蚕Bm5细胞、Sf2 1细胞中都有转录活性 ,但是活性都很低 ;家蚕滞育激素在体外条件下对家蚕海藻糖酶基因启动子活性的调节有明显的剂量效应 ,13～ 33nmol/L时有明显的增强作用 ,由此推测来自家蚕卵巢的Bm5细胞可能存在与滞育激素作用的受体。     

合成滞育激素对家蚕卵碳水化合物代谢的影响

为了进一步阐明家蚕滞育激素在诱导滞育卵发生以及对蚕卵滞育过程中碳水化合物代谢的调节作用 ,对低温 (16℃ )暗催青的二化性品种大造 ,在化蛹初期注射合成滞育激素 ,诱导其产下滞育卵 ,然后将这种滞育卵分别用 2 5℃和 5℃保护 ,调查其在滞育过程中糖元、海藻糖、山梨醇和甘油量的变化。结果发现 ,从化蛹第 3天开始 ,每天注射 15 0pmol/头合成滞育激素 ,连续 3次 ,可得到 70 %左右的滞育卵。这种滞育卵在产卵初期糖元的含量与自然滞育卵相似 ,但山梨醇的含量仅有自然滞育卵的 5 0 %左右。诱导滞育卵在 5℃中保护时 ,解除滞育的时间比自然滞育卵提前 ,孵化率比自然滞育卵低 2 0 %左右。未孵化卵大多在转青期死亡。由上述结果推测 ,这种诱导滞育卵在产卵初期糖元与山梨醇的代谢间存在某种障碍 ,从而影响山梨醇的合成 ,导致滞育的提前解除和胚胎发育异常。     

一个二化性家蚕醛酮还原酶基因的克隆及序列与表达分析

醛酮还原酶(aldo-keto reductase,AKR)超级家族成员以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为其辅酶,将醛酮类化合物还原成相应的醇类,其作用底物范围广泛,包括糖类、脂肪醛和甾体类激素等,在许多重要生物学反应中发挥关键作用。以二化性家蚕品系秋丰为材料,利用RT-PCR分别从滞育命运组和非滞育命运组克隆出AKR蛋白的cDNA序列。AKR蛋白序列由343个氨基酸组成,与黑腹果蝇和人的AKR分别有43%和38%的序列一致性。基于蛋白质序列构建的系统发育树显示,家蚕AKR蛋白属于AKR2E亚家族,其氨基酸序列与该家族成员序列一致性超过30%,故命名为AKR2E-like。将akr2e-like基因的cDNA序列克隆进表达载体pET-28a(+)中进行原核重组表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析显示重组蛋白被成功表达。qRT-PCR分析表明,ark2e-like基因表达受发育环境调节:在滞育诱导条件下,该基因在家蚕化蛹早期的表达量持续增加,在化蛹后第4天mRNA丰度达到最高值;而在非滞育诱导条件下,化蛹后ark2e-like基因表达量并无明显波动。上述结果表明,ark2e-like基因有可能在家蚕二化性品系的滞育准备期起关键作用。