杜仲Dirigent1基因的原核表达及蛋白纯化

植物Dirigent蛋白认为指导木脂素和木质素的生物合成,同时在生物防御应答,次生代谢调控和病原体抗性的过程中起到了重要的作用。本研究以实验室前期克隆得到杜仲Dirigent1基因(EuDIR1)为基础,利用基因重组技术构建pET-30a-EuDIR1原核表达载体。重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,在15℃下0.1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导6 h后,蛋白的沉积量达到最高值,表达模式主要为包涵体。对包涵体进行溶解,使用镍-亚氨基二乙酸亲和层析柱进行纯化。收集纯度较高的洗脱组分进行透析复性,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot鉴定重组蛋白。结果表明,成功构建了pET-30a-EuDIR1原核表达载体,表达菌株诱导后在相对分子质量约18 kD处有1条特异性蛋白条带,包涵体纯化、复性后,经Western Blot鉴定,获得可溶性且纯度较高的重组蛋白。实验中得到的EuDIR1蛋白为体外生化实验提供了科学依据。     

SikCDPK1基因EF-hand的定点突变、原核表达及蛋白纯化

钙依赖性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CDPK)通过与Ca²⁺相互作用,在植物响应各种逆境胁迫的过程中发挥重要作用,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca²⁺的关键结构。为进一步研究具有极强耐寒性的天山雪莲对逆境的响应机制,本研究采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因EF-hand基序的第435、第471、第507和第540位氨基酸分别由E(谷氨酸)突变为Q(谷氨酰胺),构建定点突变原核表达载体,转化表达菌株E. coli BL21 (DE3),使用IPTG诱导蛋白表达,利用亲和层析系统对重组蛋白进行纯化。结果显示,重组菌株能够成功表达出目的重组蛋白,重组蛋白可溶性表达量较高的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h,最后成功纯化出符合预期大小的可溶性蛋白,为进一步探究SikCDPK1中不同EF-hand基序的生物学功能提供了实验依据。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

小麦TaSIM蛋白的原核表达与纯化及Western blotting检测

为了获得TaSIM(Salinity-induced R2R3-MYB)基因的纯化蛋白,以便研究TaSIM转录因子的DNA结合特异性.本研究以含有pET28a-TaSIM原核表达载体的大肠杆菌BL21为材料,用0.5 mmol/L IPTG,在37 ℃诱导TaSIM融合蛋白表达2 h,收集上清液,采用Ni-NTA柱纯化...     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的表达

重组胸腺素alpha 1(Tα1)基因在大肠杆菌中进行表达。根据大肠杆菌密码子偏爱性合成Tαl基因并连接到pMD18-T载体上,双酶切回收的Tαl插入到pET32a后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,经15%SDS-PAGE检测,胸腺素αl获得可溶性表达。检测到与目的蛋白相对分子量(21.8KDa)相符的条带。重组胸腺素alpha 1在大肠杆菌中获得可溶性表达。     

花烟草NaD1基因的原核表达及纯化

花烟草的花中特异地存在一种植物防御素Nicotiala alata defensin 1 (NaD1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然免疫系统中起着重要作用。该蛋白还对哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用。本研究构建了原核表达载体p ET28a-NaD1,将其转化到Rosetta菌株中进行诱导表达并优化了诱导表达条件,发现在25℃下,0.5 mmol/L IPTG诱导表达过夜后,目的蛋白积累量达到最高,并主要以可溶性蛋白形式存在。利用Ni柱对NaD1重组蛋白进行亲和层析纯化,产物经Western Blot鉴定发现在16.8 kD处有特异性条带,与预期的NaD1重组蛋白大小一致。本研究结果为进一步研究NaD1蛋白的作用机制提供实验依据。     

三角褐指藻F-box like蛋白基因的原核表达及蛋白纯化

F-box蛋白是SCF复合体的重要组成元件之一,能通过泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system,UPS)参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程.为了探究一个F-box like蛋白在三角褐指藻细胞周期调控过程中的作用机制,本研究从三角褐指藻中克隆得到一个F-box like...     

小麦(Triticum aestivum L.)UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的原核表达及蛋白纯化

为了研究小麦抗赤霉病相关UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的功能,利用TaUGT6基因的编码区构建了原核表达载体pGEX-TaUGT6,转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达对培养温度、培养时间进行了探索;然后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测重组蛋白,进行蛋白纯化。结果表明:Ta UGT6的编码区为1 473 bp,导入大肠杆菌的TaUGT6基因能够被诱导表达,重组蛋白在25℃经过夜诱导和37℃经6 h诱导效果较好,表达重组蛋白的表现分子量与理论分子量基本一致,利用蛋白层析系统获得了纯度较高的重组可溶性蛋白。本研究为今后通过体外酶活分析、抗体制备等方法深入研究该基因的功能提供了依据。     

小麦水通道蛋白TaTIP1-4DL基因的克隆及表达分析

TIPs家族是一类位于液泡膜上的膜内在蛋白,负责调节细胞膨压,可以响应植物逆境胁迫。为进一步探究小麦中TIPs基因的表达模式和生物学功能,利用同源克隆的方法从小麦旗叶中扩增出TaTIP1-4DL基因,其编码区序列全长771 bp,编码257个氨基酸。生物信息学分析显示:该蛋白分子质量为26.3 ku,理论等电点为6.82,为疏水稳定性蛋白;三级结构为保守的沙漏结构,包含6个长α螺旋和2个短α螺旋,符合水通道蛋白的经典模型;氨基酸比对和进化树分析表明,小麦中的TaTIP1-4DL蛋白与山羊草、二穗短柄草中的同源关系较近,并包含6个跨膜区和2个保守的NPA基序;启动子顺式作用元件中包含与逆境相关的响应元件。组织特异性表达分析显示,TaTIP1-4DL基因在小麦不同组织器官中均有表达,且叶片中的表达量最高,茎中最少。胁迫表达分析表明,干旱、脱落酸、高盐对叶片和籽粒中TaTIP1-4DL基因的表达有不同程度的诱导,表达水平普遍呈现先上调后下降的趋势,其中干旱对叶片中该基因的诱导水平最高,干旱处理6 h后,叶片中的表达量达到胁迫前的14倍。     

花椒几丁质酶基因ZaCHIT1的原核表达及纯化

花椒中含有的几丁质酶基因ZaCHIT1在植物病程中诱导相关蛋白表达,在植物对抗真菌病害过程中起重要作用.本研究将原核表达载体pMCSG19-ZaCHIT1转化到大肠杆菌BL 21(DE 3)菌株中,之后进行IPTG诱导表达并从诱导温度、时长和IPTG浓度3个方面检测对ZaCHIT 1重组蛋白表达的影响,以获得最优体系,...     

组织特异表达启动子RSS1P在转TiERF1基因小麦中的应用

从水稻叶片中克隆了一个韧皮部组织特异表达的水稻蔗糖合酶启动子(RSS1P),将RSS1P与中间偃麦草乙烯反应因子基因TiERF1相融合构成组织特异表达的TiERF1基因表达盒,取代pAHC20中Ubi::bar基因表达盒,构建成无选择标记的韧皮部组织特异表达的pA20-RSS1P::TiERF1载体。利用基因枪将pA20-RSS1P::TiERF1与pAHC20载体混合、共轰击小麦品种扬麦12的幼胚愈伤组织,获得转RSS1P::TiERF1基因小麦。对该转基因小麦T₀和T₁代植株进行PCR、PCR-Southern、半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析,证实外源RSS1P::TiERF1基因已转入受体,并且具有可遗传性;转入的RSS1P::TiERF1基因仅在根、茎、叶中表达,以根部表达量最高,在种子内不表达。纹枯病抗性鉴定和主要农艺性状考察结果表明,与受体扬麦12相比,转RSS1P::TiERF1基因小麦对纹枯病的抗性有明显提高,与转Ubi::TiERF1基因小麦的抗病性相当,而且转RSS1P::TiERF1基因小麦的农艺性状没有明显改变,说明可以利用RSS1P启动子创造更实用的转基因小麦新种质。     

甘薯二羟基黄酮醇还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据其它作物的二羟基黄酮醇还原酶（DFR）基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR方法从甘薯块根中分离出花青素合成相关基因DFR基因,并定名为ibDFR。该基因全长1232bp,编码398aa。核甘酸序列分析表明,与牵牛相似系数达85%,与烟草的相似系数达到67%,与马铃薯的相似系数达75%。将ibDFR连接到pET30a（＋）载体中,检测ibDFR在大肠杆菌中的表达。实验结果表明ibDFR蛋白质分子量大小与推算一致,能在大肠杆菌中转录表达。     

马铃薯无机焦磷酸酶基因cDNA在大肠杆菌中的表达及蛋白质特征分析

通过调节蔗糖代谢途径中的协同因子无机焦磷酸（PPi）可以调控马铃薯块茎的休眠和发芽特性。本研究将马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）基因（Gen Bank Accession No：EF091820）与载体pET-28a融合,构建了原核表达载体pET—PPA,然后导入大肠杆菌BL21（DE3）中,经SDS-PAGE分析表明PPase基因在大肠杆菌中能够表达。用生物学软件对PPase基因及其编码的蛋白质分析表明,该PPase基因与与茄属的同源性高达89％-97％,与其他物种PPase基因的同源性在77％-80％之间;系统进化树分析表明PPase与茄科茄属和藜科甜菜属的进化类群最接近;其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点,没有跨膜区;蛋白质二级结构预测显示,有63个氨基酸可能形成α-螺旋结构,38个氨基酸可形成延长链;通过亚细胞定位可知,它主要是一种细胞质和线粒体基质蛋白。     

鸡 SIgM λ 轻链蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

应用 RT-PCR 技术从鸡法氏囊 B 细胞总 RNA 中克隆出 SIgM λ 轻链基因,并将其进一步克隆于 pET-28a 载体 T7 启动子的下游,构建了 pET-SIgM λ 原核表达载体。转化宿主菌 BL21(DE3),经 IPTG 诱导,成功表达了25.5 kDa 的鸡 SIgM λ 轻链蛋白。经 SDS-PAGE 和 Western-blotting 分析, 表达产物以包涵体形式存在,且能与 His-Taq 单抗特异性反应,为进一步研究 SIgM 的免疫学功能及其他生物学功能奠定基础。     

外源类甜蛋白基因在马铃薯中的表达

将“津引薯８号”马铃薯薄版和含有ＣaMV35S启动子控制的类甜蛋白（ＴＬＰ）基因与紧密连锁的Ｕbiquitin启动子控制的bar标记基因的农植菌双元表达域体进行共培养。切下马铃薯薄片表面产生的幼芽,用含有除草剂bialaphos的ＭＳ培养其进行初步筛选。当获得的生根抗性芽生长成株后用ＴＬＰ蛋白抗体和ＴＬＰ基因特异引我对成株进行间接ＥＬＩＳＡ检测和ＰＣＲ检测。两种检测结果一致率为９０％,推断以bar基因为筛选标记、紧密连锁 的外源类甜蛋白基因已经进入马铃薯基因组并利以表达。     

DREB1B基因在转基因小麦后代的稳定表达

本研究对基因枪导入了pBAC128F/R质粒(含有玉米Adh1内含子1的CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记,以来自拟南芥菜逆境诱导表达类型--亲水蛋白rd29b基因的启动子驱动脱水应答转录因子DREBIB基因的逆境诱导表达类型质粒)的T4代转基因小麦进行了稳定表达研究.PCR、PCR-Southem和Southern杂交分析表明,外源转录因子DREBlB基因已稳定整合到转基因株系的基因组中.半定量RT-PCR结果表明,部分转基因株系的DREB1B基因的相对表达量有所增强.叶片除草剂抗性检测结果显示有8个转基因株系可抗到150 mg/L.叶片脯氨酸含量测定结果表明,有4个株系(编号为1,18,30和76)的脯氨酸含量提高幅度较大,同一株系,干旱与未干旱处理相比,脯氨酸含量提高了3～5倍.干旱处理后的转基因植株与非转基因植株相比,脯氨酸含量高2～3倍.在干旱条件下,T4代田间小区产量统计数据分析结果表明,有4个转基因株系(编号为30,51,70和76)的产量与非转基因植株相比有显著增加.研究表明,利用逆境诱导型rd29b基因的启动子来增强外源DREB1B基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性.     

低氧诱导透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌中的表达

合成透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的天然低氧启动子,与vgb结构基因拼接得到570 bp的vgb基因,将该基因克隆到pUC18质粒中重组为pUC_LV质粒,转化大肠杆菌得到重组子。通过低氧诱导10 h后,重组菌的密度较对照增加了67.4%,经SDS_PAGE和CO差光谱分析证明重组菌表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb)。