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1.
猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
2.
非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 总被引:1,自引:1,他引:0
为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45 ku,且具有良好的生物活性。 相似文献
3.
传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达 总被引:11,自引:1,他引:10
将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB基因,通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中,构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB,将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA(Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞,经3轮蚀斑纯化,获得重组病毒并命名为rpVL-ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中,直接免疫荧光试验和Dot-ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达,表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。 相似文献
4.
为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础. 相似文献
5.
为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础. 相似文献
6.
为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白,试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因,将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上,构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞,获得P0代重组杆状病毒,经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒,将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养,收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白,通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明:经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带;通过荧光显微镜观察,在转染后第1天就出现绿色荧光,第4~5天出现大量绿色荧光,P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4~5天出现大量绿色荧光;P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现... 相似文献
7.
本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
8.
利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28 ℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1:102 400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。 相似文献
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为真核表达鹅细小病毒(GPV)融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。 相似文献
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《中国家禽》2017,(15)
采用RT-PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的膜(M)蛋白基因,将其克隆至pFastBac~(TM)/HBM-TOPO杆状病毒转移载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rHBM-M;将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定表达的M蛋白。IFA检测可见重组杆状病毒感染后72h细胞出现特异性荧光,Westernblot检测可见大小约为26ku的特异性蛋白带,表明该重组M蛋白在Sf9昆虫细胞中成功获得表达。研究为IBVM蛋白的生物学功能、IBV诊断试剂和新型疫苗制备等奠定基础。 相似文献
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为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆粒。将重组杆粒转染SF9细胞(昆虫卵巢细胞),盲传3代,获得重组病毒。将重组病毒接种SF9细胞96 h后,通过细胞免疫荧光检测、Western blot和电镜观察对其进行验证,并利用噬斑法检测其效价。结果显示:成功构建重组质粒pFastBac-PCV-2-3-Cap,获得了重组杆粒rAcBacmid-PCV-2-3-Cap,并制备出重组杆状病毒rvAc-PCV-2-3-Cap。重组病毒感染SF9细胞后,目的蛋白成功表达,并可以形成病毒样颗粒,病毒效价为3.41×106 PFU/mL。本试验成功在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达了PCV-2-3-Cap,为防治PCV-2和PCV-3混合感染的二联疫苗研究提供了数据支持。 相似文献
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15.
《中国家禽》2015,(11)
为获得具备良好抗原性和生物活性的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)env基因主要功能区的表达产物,采用特异性引物分别从保存的p MD18T-envHB2010质粒、PIRES2-EGFP中扩增ALV-J env基因主要功能区和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,酶切、连接后插入p Fast Bac Daul载体,构建杆状病毒转移载体p Fast Bac Daul-env-EGFP,将其转化DH10Bac感受态细胞制备重组杆粒Bacmid-env-EGFP,转染Sf9细胞进行真核表达。结果显示,转染了重组杆粒的Sf9细胞在倒置荧光显微镜下呈现亮绿荧光;以ALV-J单克隆抗体JE9进行Western blot检测,转染重组杆粒的Sf9细胞检测出约85 ku的条带。结果表明,目的基因在Sf9细胞中得到了良好的表达,为进一步研究ALV-J提供基础试验材料。 相似文献
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Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达 总被引:1,自引:1,他引:0
以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。 相似文献
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利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。 相似文献
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利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础. 相似文献
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仙台病毒F基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达及抗原性分析 总被引:2,自引:0,他引:2
为真核表达仙台病毒(SeV)融合蛋白(F)基因,本研究根据GenBank登录的SeV F基因序列设计合成一对特异性引物,以pMD18-T-F阳性重组质粒为模板扩增F基因,并将其克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac HTa中,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆粒rBacmid-F,经PCR鉴定正确将rBacmid-F转染Sf9细胞,连续传代后,细胞病变明显。经SDS-PAGE分析,成功表达了相对分子量为65ku左右的F蛋白,western blot和ELISA分析表明重组F蛋白具有良好的抗原性。 相似文献
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利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV,VP7基因序列的同源性为99.8%,将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子,纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒,通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确投入,将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达。 相似文献