不同冷冻保护剂对犬精子冻存的影响

本试验通过对比冷冻保护剂和冷冻程序,优化犬精液冷冻保存方法,比较了不同甘油、乙二醇浓度、不同平衡时间对犬精子冷冻复苏率及精子顶体完整率的影响。结果发现,甘油作为冷冻保护剂时,其对精液冷冻保存后的效果明显优于乙二醇,当甘油浓度为4%时,平均冷冻复苏率最高;冷冻平衡时间为1 h最佳。因此,犬精液在冷冻保存时,甘油浓度为4%,平衡60 min,可获得平均39.21%±0.013%的冷冻复苏率,且比较稳定。     

不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠耳皮肤成纤维细胞冻存效果的影响

通过比较不同冷冻保存方法和冷冻保护剂对小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻-解冻复苏后细胞存活率、48h贴壁率和细胞生长曲线的影响,筛选适宜的小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻保存方法和冷冻保护剂。结果表明,以100mL/L二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂进行小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻保存时,方法3处理组解冻复苏后细胞存活率和培养48h细胞贴壁率均高于方法2处理组(P>0.05),并分别极显著高于方法1和方法4。采用方法3进行冷冻保存时,以100mL/L DMSO作为冷冻剂的细胞贴壁率显著高于100mL/L甘油(GL)组(P<0.05),且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。因此,宜选择100mL/L胎牛血清(FBS)+100mL/L DMSO+DMEM作为冷冻保护液,采用方法3进行小鼠耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存。     

绵羊前体脂肪细胞的原代培养及分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞的原代培养方法,探讨反刍动物脂肪沉积机理.以1日龄羔羊的肾周脂肪组织为试验材料,采用组织块法和酶消化法分离培养前体脂肪细胞,观察形态学变化,测定生长曲线,油红O染色检测细胞内脂肪含量,并用实时定量PCR法检测脂蛋白脂酶、过氧化物体增殖剂活化受体γ、脂肪酸合酶的表达量.结果表明:原代培养的细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前体脂肪细胞的形态特征和基因表达特性,为绵羊前体脂肪细胞.本试验成功建立了绵羊前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程.     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量.BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液.A组:85％ DMEM+10％胎牛血清+5％ DMSO;B组:80％ DMEM+ 10％胎牛血清+10％ DMSO;C组:75％ DMEM+10％胎牛血清+15％ DMSO;D组:70％ DMEM+10％胎牛血清+20％ DMSO;E组:85％ DMEM+5％胎牛血清+10％ DMSO;F组:75％ DMEM+15％胎牛血清+10％ DMSO;G组:70％DMEM+20％胎牛血清+10％DMSO;H组:80％DMEM+10％胎牛血清+10％甘油;I组:70％ DMEM+10％胎牛血清+20％甘油;J组:60％ DMEM+10％胎牛血清+30％甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存.分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst 33258双染计算凋亡率.结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P＞0.05);传代后B组细胞的生长状况最好.     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM＋10%胎牛血清＋5%DMSO;B组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%DMSO;C组：75%DMEM＋10%胎牛血清＋15%DMSO;D组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%DMSO;E组：85%DMEM＋5%胎牛血清＋10%DMSO;F组：75%DMEM＋15%胎牛血清＋10%DMSO;G组：70%DMEM＋20%胎牛血清＋10%DMSO;H组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%甘油;I组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%甘油;J组：60%DMEM＋10%胎牛血清＋30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性（P〉0.05）;传代后B组细胞的生长状况最好。     

绵羊前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞体外培养方法,为从细胞生物学层面研究绵羊脂肪代谢提供基础。选取1只3月龄杜泊羔羊,颈部处死后取腹股沟脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得前体脂肪细胞,在完全培养液中培养。当细胞汇合成单层后,用MDI诱导剂(1μmol/L地塞米松,10 mg/L胰岛素,0.5 mmol/L IBMX)诱导2 d,再用胰岛素分化剂(10 mg/L胰岛素)分化2 d之后,细胞分化成脂肪细胞,细胞内出现脂滴,随着时间的延长脂滴汇合,最终脂滴充斥整个细胞。通过细胞形态学动态观察、生长曲线绘制、油红O染色以及诱导分化测定等试验证明,这些细胞是功能活跃的前体脂肪细胞,并在体外重现了其增殖分化的全过程。结果提示,绵羊羔羊腹股沟脂肪组织中存在前体脂肪细胞,且可用以建立绵羊前体脂肪细胞的细胞系,这为从细胞生物学层面研究绵羊脂肪代谢提供了重要基础。     

细胞冻存保护剂二甲基亚砜的细胞毒作用

二甲基亚砜(DMSO)是目前最好的细胞冻存保护剂,但也是一种对细胞毒性很大的化学试剂。本研究结果表明,培养液中DMSO浓度为10％时,细胞生长抑制率近100％;1‰浓度时抑制率为35％;即使是0.04‰的浓度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。我们认为,培养液中残存的DMSO是冻存细胞复苏后出现细胞毒现象的主要原因。因此我们提出,冻存细胞时操作过程要迅速;细胞融化后务必洗涤,尽量去除DMSO,是减少其对细胞毒性作用、保证细胞尽快恢复生长增殖的关键步骤。     

细胞冻存保护剂二甲基亚砜的细胞毒作用

二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。本研究结果表明，培养液中ＤＭＳＯ浓度为１０％时，细胞生长抑制率近１００％；１‰浓度时抑制率为３５％，即使是０．０４‰的浓度，ＤＭＳＯ对细胞的生长也有不利的影响。我们认为，培养液中残存的ＤＭＳＯ是冻存细胞复苏后出现的细胞毒现象的主要原因。因此我们提出，冻存细胞时操作过程要迅速；细胞融化务必洗涤，尽量去除ＤＭＳＯ，     

AMPK调控绵羊肌内前体脂肪细胞分化的研究

旨在研究AMPK在羔羊肌内前体脂肪细胞分化中的作用及机制。本研究采集3日龄羔羊背最长肌,采用差速贴壁法分离肌束膜中原代细胞。改变AMPK与Wnt信号通路的活性并诱导细胞成脂分化,采用qRT-PCR和Western blot方法检测脂肪细胞分化关键基因及蛋白的表达,应用油红O染色观察成熟脂肪细胞的油滴情况。结果表明,AMPK激活明显减少了油红的着色,极显著抑制了PPARγ、C/EBPα和aP2成脂关键基因的mRNA表达及降低了对应的蛋白含量(P0.01),而抑制AMPK活性则表现出相反的结果。激活Wnt信号通路活性抑制了肌内前体脂肪细胞的分化,极显著降低PPARγ(P0.01)和C/EBPα(P0.01)mRNA表达,显著减少aP2的mRNA表达(P0.05),极显著降低了对应蛋白的含量(P0.01),而抑制Wnt信号通路活性则促进了细胞的成脂分化。AMPK的活性变化未影响β-catenin的转录,但极显著改变了β-catenin的蛋白表达水平(P0.01)。进一步研究表明,AMPK活化后极显著增加了GSK3β的磷酸化水平(P0.01),降低了其活性。结果显示,AMPK通过改变GSK3β的磷酸化水平影响胞内β-catenin稳定性,进而影响羔羊肌内前体脂肪细胞的成脂分化。     

不同冻存液对无血清BHK21细胞冷冻效果的影响

正在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的今天,细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。冷冻保存是细胞长期保存的唯一方法,有利于减少细胞被微生物污染和细胞之间交叉污染的危险性,减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变以及避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。大多数的细胞若无特别的要求,都可冷冻保存于-130℃以下长达多年。动物细胞冷冻保存,为细胞培养工作带来很大的机动灵活性,降低了人     

冻胚日龄对绵羊胚胎移植效果的影响

受体羊同期发情处理后 ,于发情后的第 4～ 7天 ,将冻胚随机移植给与其胚龄相同的受体羊有黄体侧的子宫角。 4日龄、5日龄、6日龄、7日龄冻胚的移植妊娠率分别为 62 5 % (15 / 2 4 、48 5 % (16/ 3 3 、42 8% (6/ 14 、3 8 7% (12 / 3 1) ,产羔率分别为 5 0 % (12 / 2 4)、45 5 % (5 / 3 3 )、42 9% (6/ 14 )、2 9 0 % (9/ 3 1)。 4日龄、5日龄与其它日龄妊娠率间差异极显著(P <0 0 1) ;羔羊初生重各日龄间差异不显著 (P >0 0 5 )。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组（1×104个细胞/mL）、2组（1×105个细胞/mL）、3组（1×106个细胞/mL）、4组（1×107个细胞/mL）4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察。结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组（P〈0.01）,贴壁率显著高于其他3组（P〈0.05）;3组细胞凋亡率显著低于其他3组（P〈0.05）;3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组(1×104个细胞/mL)、2组(1×105个细胞/mL)、3组(1×106个细胞/mL)、4组(1×107个细胞/mL)4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察。结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组(P<0.01),贴壁率显著高于其他3组(P<0.05);3组细胞凋亡率显著低于其他3组(P<0.05);3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组(1×104个细胞/mL)、2组(1×105个细胞/mL)、3组(1×106个细胞/mL)、4组(1×107个细胞/mL)4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察.结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组(P＜0.01),贴壁率显著高于其他3组(P＜0.05);3组细胞凋亡率显著低于其他3组(P＜0.05);3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好.     

乙二醇对绵羊冻精效果的研究

以含甘油的四组然释液为对照组，以等量的乙二醇替换甘油作为相应的试验组，研究乙二醇对绵羊冻精效果的影响。结果表明，试验组冻后精子活力、顶体完整率显著高于对照组（P＜0．05），并确定了3号试验组稀释液为最适精液冷冻配方，其乙二醇浓度为10％时冷冻保护效果最好。     

棕榈酸对绵羊前体脂肪细胞增殖的影响

目的:为了探究不同浓度棕榈酸对体外培养绵羊前体脂肪细胞增殖的影响。方法:体外复苏培养小尾寒羊前体脂肪细胞,在培养液中分别添加浓度为100、150、200、250、300和350 μmol/L的棕榈酸(Palmitic Acid,PA),培养1、3、5、7和9 d后,用MTT法检测细胞增殖情况。结果:复苏的前体脂肪细胞活率为93%,细胞形态呈长梭型,72 h后细胞汇合成单层致密;PA作用于前体脂肪细胞1 d后,浓度为150 μmol/L促进细胞增殖,且与对照组相比差异极显著。作用时间延长3～9 d后,浓度为100 μmol/L和150 μmol/L均促进细胞增殖,浓度在200～350 μmol/L抑制细胞增殖,且各组之间差异极显著。结论:不同浓度PA作用绵羊前体脂肪细胞不同时间后,对细胞增殖效果不一样,作用1 d后,浓度为150 μmol/L促进细胞增殖,而作用时间延长至3～9 d后,浓度为100 μmol/L和150 μmol/L均促进细胞增殖,200～350 μmol/L抑制细胞增殖。     

KLF2对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响

旨在克隆山羊KLF2基因的锌指结构域序列,明确其在组织及细胞表达模式,最终阐明其对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能发挥作用的方式。本研究以5只1周岁左右的健康简州大耳羊为试验动物,利用RT-PCR、细胞培养、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）、RNA干扰等方法克隆KLF2基因锌指结构,明确KLF2基因的时空表达特性并阐明其对肌内前体脂肪细胞分化的影响。结果显示,本研究获得的山羊KLF2锌指结构域为454 bp（KU041748.1）,且该结构域与绵羊、牛、小鼠的同源性为100%。KLF2在山羊各组织中存在广泛表达,且在肺和腹间脂肪中存在较高水平表达（P<0.05）。KLF2在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达呈先下降又上升然后又下降趋势,且在成脂诱导分化12 h呈最低表达水平,显著低于在未分化的前体脂肪细胞中的表达水平（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰KLF2基因可明显促进山羊肌内脂肪细胞的脂滴积聚;并且PPARγ和C/EBPβ表达量伴随着这个过程分别极显著上调48.5%（P<0.01）和显著上调43.6%（P<0.05）;同时该家族中的KLF1、KLF13、KLF14、KLF15和KLF16表达水平极显著升高（P<0.01）,KLF4显著下降（P<0.05）,KLF3、KLF6、KLF8、KLF9及KLF11极显著下降（P<0.01）。山羊KLF2的锌指结构域与其他物种同源性高度保守,且其在山羊肺和腹间脂肪中表达量较高（P<0.05）。同时KLF2是山羊肌内脂肪细胞分化的负调控因子,并且可能通过PPARγ和C/EBPβ基因来发挥作用,且与其他KLFs基因存在等级调控现象。     

绵羊冻精配种效果观察

为了尽快适应畜牧业生产发展的需需,提高绵羊的生产性能,解决我市种公羊短缺问题,我市率先推广应用了绵羊冻精配种技术。1984年,密山县从北京中国农业科学院畜牧研究所取来冻精,开展了冻精配种试验,取得了冻配成功。1985年在小群试验的基础上,开展了大群绵羊冻     

小尾寒羊SP1基因克隆及其对前体脂肪细胞分化的影响

试验旨在对小尾寒羊特异性蛋白1（specificity protein 1,SP1）基因进行克隆和序列分析,并研究SP1基因对前体脂肪细胞分化的影响。选取1月龄小尾寒羊尾部脂肪组织进行前体脂肪细胞的分离、培养和诱导分化;用重叠PCR法克隆SP1基因编码区（coding DNA sequence,CDS）;用生物信息学软件分析SP1基因CDS,并对其编码蛋白的结构、功能结构域、亚细胞定位、翻译后修饰进行预测;用慢病毒包装SP1基因过表达、干扰及对照质粒转染293T细胞后,收取病毒液感染小尾寒羊前体脂肪细胞;用油红O染色检测脂滴沉积能力;用实时荧光定量PCR检测SP1基因和成脂标志基因的mRNA表达量。结果表明,小尾寒羊SP1基因CDS全长2 340 bp,编码779个氨基酸;序列相似性分析显示,小尾寒羊SP1基因CDS及其编码序列与绵羊、山羊的相似性最高,其次是牛、马、猪、人、小鼠、大鼠,与鸡的相似性最低,系统进化分析结果与之相符;SP1蛋白定位于细胞核,有109个磷酸化位点,其二级结构由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链4种结构组成,所占比例分别为16.94%、8.60%、54.17%和20.28%,二级结构和三级结构均存在3个锌指结构域;过表达、干扰及对照质粒转染293T细胞,每组细胞皆出现较强绿色荧光,载体成功转染至293T细胞;病毒液感染小尾寒羊前体脂肪细胞并分化12 d后,过表达组SP1基因表达量极显著高于对照组（P<0.01）,干扰组SP1基因表达量极显著低于对照组（P<0.01）;过表达SP1基因极显著上调成脂标志基因mRNA的表达量（P<0.01）,产生更多脂滴;干扰SP1基因则结果相反。因此,SP1基因对小尾寒羊尾部前体脂肪细胞分化具有正向调控的作用。