柑橘钙离子结合蛋白基因克隆及植物表达载体构建

以伏令夏橙叶片中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到一条约600bp的富含柑橘钙离子结合蛋白（CsCaBP）的基因片段,将此片段克隆到pMD-19T中,经测序分析该片段与甜橙基因组中的对应序列完全吻合。设计2对带有限制性内切酶位点的特异性引物,以cDNA为模板扩增到2个CsCaBP片段,经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pFGC5941的查耳酮合成酶(CHSA)内含子两侧,构建成功CsCaBP基因的RNA干扰载体,但未得获转基因植株。将钙离子结合蛋白基因的正向片段定向克隆到具有CaMV35S启动子的pFGC5941表达质粒上,构建成功CsCaBP过量表达载体。将构建好的表达载体导入根癌农杆菌LBA4404菌株,转化酸橙下胚轴,经PCR检测,获得10株过量表达转基因植株。     

融合标记基因NPTⅡ∷GFP在柑橘遗传转化中筛选效率的研究

绿色荧光蛋白（GFP）基因和新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因被广泛应用于植物的遗传转化中。为了研究融合标记基因NPTⅡ::GFP在柑橘遗传转化中的筛选效率,本实验将CaMV35S组成型启动子驱动的nptⅡ∷GFP融合标记基因表达载体pNGM和由CaMV35S启动子分别驱动NPTⅡ、GFP两个基因的表达载体pNPTII-GF经农杆菌介导法转化锦橙上胚轴。GFP绿色荧光检测结果显示,GFP在转NPTⅡ∷GFP融合基因植株中强烈表达,荧光强度与非融合GFP转基因植株的表达水平相当。NPTⅡ∷GFP融合标记基因对锦橙的转化效率为10.8%,与非融合NPTⅡ基因的转化效率（11.0%）没有明显差异。研究结果表明,NPTⅡ∷GFP融合标记基因是一个有效的柑桔遗传转化筛选标记基因。     

紫花苜蓿MsZIP基因RNAi表达载体的构建及苜蓿转化

根据已经得到的MsZIP基因序列(GenBank序列号:HQ911778),设计两对含有酶切位点的引物ZIPF1/ZIPF2和ZIPR1/ZIPR2,合成用于构建干扰载体的正反义片段。将正反义片段插入到载体pART27中,构建成为含有发夹结构的RNAi干扰载体pART-F-R。采用农杆菌介导的方法,将该干扰载体成功转化到苜蓿中,得到9株抗性苗,选取其中的3株进行PCR鉴定,结果表明成功得到转基因苜蓿。     

柑橘黄龙病病原遗传多样性研究进展

柑橘黄龙病是世界范围内最具毁灭性的柑橘病害之一,严重阻碍了柑橘产业的发展。对柑橘黄龙病病原的种群分化及遗传变异进行研究有助于了解柑橘黄龙病的流行、起源与进化。近年来黄龙病病原遗传多样性研究已成为热点之一,本文简要概述国内外在该领域的研究进展。     

紫花苜蓿光敏色素A基因片段的克隆及其RNA干扰载体的构建

苜蓿(Medicago sativa L.)的秋眠性是一种光周期效应。研究植物体内重要的光受体-光敏色素A(phyto-chromeA,phyA),可能揭示其调控苜蓿秋眠性的机理。为研究其与苜蓿秋眠性的关系,本研究根据RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术原理,以紫花苜蓿幼嫩叶片为材料,提取总RNA,选取基因cDNA序列同源性较低区域设计特异性引物,并引入相应的酶切位点,利用RT-PCR克隆phyA正、反向片段,经过3次亚克隆,构建了phyA的RNAi表达载体,制备了适合转染植物组织的农杆菌菌液,为获得缺失phyA植株创超了条件。     

钙依赖蛋白激酶基因表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

将钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因插入到植物表达载体pBI121上,构建成特异性表达载体pBI121-CDPK,并采用农杆菌介导法将其转化进入拟南芥Arabidopsis thaliana Columbia生态型品种中,获得了卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,拟南芥基因组中含有此抗性基因.     

RNA干扰技术及其在遗传育种中的应用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是二十世纪末发现的一种基因沉默机制,具有广大的应用前景。本文就RNAi的可能机制、特征、RNAi技术中存在的问题及其在基因组、基因表达调控和干细胞研究、基因治疗、育种等方面的应用进行了综述。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中.     

柑橘黄脉病毒研究进展

柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV）引起的柑橘黄脉病是一种新近发生的柑橘病害。CYVCV可侵染大多数柑橘属植物,其中以对柠檬和酸橙的为害最为严重,造成植株树势衰弱、产量降低。本文对CYVCV的分类地位、生物学特征和分子生物学特性进行了总结,重点阐述了运用生物学、血清学和分子生物学检测CYVCV的研究进展,并介绍了CYVCV的防治方法,最后对其亟待解决的问题进行了展望,旨在为该病的防治提供参考。     

柑橘黄脉病毒在重庆柑橘产区的发生分布及趋势分析

柑橘黄脉病是我国新近发生的一种病毒病害,其在国内的分布尚不清楚。本研究于2015-2016年在重庆市15个区县的41个果园进行柑橘黄脉病发生情况调查。结果表明,在检测的1086个柑橘样品中有110个样品感染了柑橘黄脉病。该病在北碚、奉节和梁平等区县零星发生,但在潼南、永川、长寿等地发生较为严重,并有加重趋势。本研究的结果将为重庆柑橘产区开展柑橘黄脉病监测与防控提供理论依据。     

柑橘衰退病毒研究进展

柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是一种广泛分布于世界各柑橘主产区的重要柑橘病毒病害,对柑橘产业的为害极大。随着我国柑橘产业的快速发展,近年来柑橘衰退病在我国多个柑橘产区爆发,造成了严重的经济损失。本文就柑橘衰退病毒的起源、类型、传播方式、蛋白功能、病毒与寄主的互作关系、茎陷点症状形成的机理和防治方法作一综述,以期为今后有效防控柑橘衰退病提供参考。     

RNA干扰文库研究进展及其应用

RNA干扰是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,存在于许多不同种属的生物体中,在生物体细胞之间进行传递,具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用.RNA干扰文库是以RNA干扰技术为基础建立的一种简单、高效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具,应用于大规模基因功能的筛选,在基因功能研究、发现新的药物靶基因和疾病相关基因等方面具有广阔的应用前景.     

RNA干扰技术及其应用研究

RNA干涉作用,是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象,是基因转录后沉默作用(PTGS)的重要机制之一.它能定向关闭生物体内某一基因,使其不发挥作用,同时不影响其他基因的功能,便于研究特定基因的功能.在后基因组时代的基因功能研究、基因治疗和药物开发中具有广阔的应用前景.     

RNA干扰技术抑制口蹄疫病毒复制研究进展

RNA干扰(RNAi)技术作为一种特异性地抑制哺乳类细胞外源性或内源性基因表达的方法,近年来在口蹄疫病毒(FMDV)防治研究中迅速发展起来。文章综述了利用RNAi技术抑制口蹄疫病毒复制的各种策略,包括化学合成或病毒载体转染构建抑制FMDV复制的小干扰RNA(siRNA)、构建多个FMDV功能区的SiRNA、交叉抑制不同血清型FMDV的siRNA的设计和双功能载体来双向防控FMDV的SiR-NA设计。RNAi干扰技术的发展,为设计防治口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

RNAi抑制猪主要病毒感染的研究进展

RNA干扰(RNAi)是外源性或内源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制。RNAi技术具有高效性和特异性,具有广阔的前景。将RNAi应用于许多病毒性疾病的治疗研究取得了显著的基因沉默效果,为病毒性疾病的预防和治疗开辟了一条新途径。     

RNA干扰抑制口蹄疫病毒复制研究进展

鉴于现有疫苗和抗病毒药物在治疗口蹄疫方面存在的局限性,寻找新型抗病毒策略势在必行,而RNA干扰正是一种有益的尝试。RNA干扰通过沉默哺乳动物细胞中的基因表达,可有效的阻断口蹄疫病毒在宿主体内的复制。论文以口蹄疫病毒引起宿主细胞病变、RNA干扰的机制及RNA干扰抑制FMDV在宿主细胞内复制为内容,探讨如何更加有效地防控口蹄疫。     

靶向口蹄疫病毒IRES区RNA干扰位点的选择及shRNA表达载体的构建与鉴定

以口蹄疫病毒WFL株为试验株,对口蹄疫病毒的IRES序列进行了保守性分析和RNA二级结构预测,推测高度保守的FMDV复制原点区域位于容易被siRNA结合的IRESRNA二级结构的环区,因此,在该区选择确定了2个siRNA干扰靶位,设计并合成能表达其小发夹结构shRNA的表达模板,克隆到含有U6启动子的真核表达载体中,建立了靶向口蹄疫病毒IRES区的siRNA真核表达系统,为进一步研究针对该区的RNA干扰对口蹄疫病毒的抑制作用打下了基础。