根癌农杆菌介导Cry1Ac基因转化‘雪青’梨获得转基因植株

 以‘雪青’梨叶片愈伤组织为外植体, 经根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的Cry1Ac基因导入‘雪青’梨。698块愈伤组织和231个Kan^r芽与携带表达载体质粒pBX203的根癌农杆菌菌株LBA4404共培养3 d后, 转入含50 mg·L^-1 Kan的筛选培养基培养30 d, 15 d转接1次。结果表明,在MS + 5 mg·L ^-1 6-BA + 0.1 mg·L^-1 IAA筛选培养基中, Kan^r芽率为34.24% , 在1/2MS + 2 mg·L^-1 IBA+ 0.5 mg·L^-1 6-BA + 500 mg·L^-1AC筛选培养基中, 15.58% Kan^r芽生根。共获得再生植株32株, 经PCR和Southern-blot分析证明, 其中4株的基因组已成功导入和整合Cry1Ac基因。     

农杆菌介导萱草植株CHS基因的转化

以萱草‘香宝’愈伤组织为外植体,以10 d为继代周期,将携有PSN1301-CHS的农杆菌EHA105菌株侵染受体材料,使CHS基因导入到萱草‘香宝’中。建立萱草遗传转化的适宜条件:抑菌剂以浓度为350 mg/L的羧苄青霉素为宜;潮霉素为转化子的筛选剂,25 mg/L为适宜的作用浓度;转化中宜选择预培养时间为2 d;农杆菌菌液浓度OD600在0.6左右,选用重悬液为MS+3%糖;侵染时间为15 min;在菌液和共培养基中同加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养基时间为2 d。     

农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究

以皇家嘎拉苹果的叶片为转化受体,通过根癌农杆菌介导将铁结合蛋白(Ferritin)基因导入受体中,诱导获得了抗性芽.经PCR检测从抗Km植株中选择到4株阳性植株,进一步经PCR-Southern杂交证实外源基因已整合到4株苹果基因组中,RT-PCR检测表明,Ferritin基因在4株转基因植株中得到了表达.     

农杆菌介导GNA基因转化菜薹

 以菜薹带柄子叶为外植体，采用农杆菌介导法将特异启动子PRS,一l与雪花莲凝集素(GNA)基因构建的嵌合基因转化菜薹，获得26株Km抗性植株，经过PCR检测和PCR-Southem杂交分析证明其为转基因植株。     

根癌农杆菌介导的CG1-400-RNase基因转化创制锦橙转基因再生植株

【目的】为了快速有效地利用基因工程的方法获得柑橘无核新种质,【方法】以我国特色多核柑橘优良品种锦橙实生苗上胚轴切段为外植体,采用根癌农杆菌介导法进行能导致种子败育基因CG1-400-RNase的转化;为快速有效地筛选出转化子,在实生苗上胚轴切段转化再生过程中,根据不同发育阶段的组织或器官对抗生素的敏感程度不同采用不同的选择压。【结果】结果表明,在抗性芽再生过程中卡那霉素质量浓度设定为50 mg.L-1,获得的362个抗性芽转入卡那霉素质量浓度为100 mg.L-1的伸长培养基中进行伸长培养后,进行早期PCR检测,获得28个阳性芽;经过不定芽诱导生根或试管嫁接,获得22株完整植株。【结论】再生植株经PCR和Southern杂交检测,获得2株目的基因以单拷贝的形式插入锦橙基因组的转基因植株,为最终获得具有无核性状且可稳定遗传的柑橘新种质奠定了基础。     

利用茎尖分生组织繁殖苹果植株

概要苹果(Malus domesfica Bor—kh)植株可由植入培养基中的茎尖分生组织再生,经移植而繁殖。茎尖分生组织外植体初期的生长和发育,仅仅要求培养基含有 BA(苄基腺嘌呤),最适浓度为5×10~(-6)M。移植后,可高频率地生产再生枝条。使用 NAA 浓度为10~(-5)M 的培养基     

根癌农杆菌介导AFL2基因转化苹果实生苗的研究

将苹果杂交种(长富2号×新红星)种子用50mg/LGA3液打破休眠,经消毒处理后接种在MS培养基上,获得无菌组培苗。以该组培苗叶片为试材,通过不同激素组合,获得适宜于植株再生的培养基为MS+NAA0.4mg/L+TDZ2.0mg/L。通过不同质量浓度的Kan筛选,证明15mg/L是Kan最佳的选择。利用含AFL2基因的根癌农杆菌LBA4404转化苹果叶片,得到转AFL2基因的阳性植株,经PCR检测,有2株出现特异性条带,证明该基因已经整合到苹果基因组中。     

农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究

以葡萄品种鲁贝的花丝为试材,在葡萄的细胞悬浮系得到胚性愈伤组织及悬浮细胞再生植株的基础上,通过农杆菌介导转化甜菜碱醛脱氢酶基因,利用共培养后GUS染色组织分析探讨了影响转化效率的各种因素,优化了转化体系。组培苗经PCR检测,证明获得了转基因葡萄植株。     

农杆菌介导Cry1Ac基因转化菊花

 用农杆菌介导法, 以茎段(节间) 为外植体, 将含有苏云金芽孢杆菌(Bt) 毒蛋白Cry1Ac基因的植物遗传载体导入菊花(切花菊) 品种‘日本黄’中, 得到126株抗性植株, PCR检测及基因组DNA的Southern杂交分析表明Cry1Ac基因已整合到菊花总DNA中, 共获得6株转基因植株。利用棉铃虫做转基因植株的盆栽和叶片平皿试验, 发现其中2株对棉铃虫具有很高抗性, 校正死亡率达90%以上; 1株对棉铃虫具有高抗性, 校正死亡率达80%以上; 3株对棉铃虫抗性较明显, 校正死亡率44.7%～60.9%。     

发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株

为了提高山定子的生根能力,用发根农杆菌转化山定子,诱导产生发根,并由发根诱导出再生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基、共培养时间以及添加乙酰丁香酮（AS）的研究,优化了发根农杆菌转化体系。当用添加AS（100μmol﹒L-1）的菌液侵染植株切段30 min,共培养3 d,在无植物生长调节剂的固体1/4MS培养基上诱导产生发根时,发根诱导率最高,达到88.89%。将发根根段在MS+BA 2.0 mg﹒L-1 +IBA 0.1 mg﹒L-1+GA3 0.1 mg﹒L-1的再生培养基上,通过愈伤组织的诱导得到再生植株,再生率3%。     

农杆菌介导几丁质酶基因转化南瓜的研究

选用"金辉一号"为试验材料,通过农杆菌介导成功地将菜豆几丁质酶基因导入到南瓜中,4株转化植株的PCR检测结果为阳性,扩增出900bp的目标带,初步证明几丁质酶基因整合到南瓜基因组中.     

农杆菌介导的蝴蝶兰基因转化系统的建立

 针刺后的蝴蝶兰‘White Hikaru’的类原球茎(PLB)，与含绿色荧光蛋白基因( )和潮霉素磷酸转移酶基因(^p￡)的pCAMBIA 1300一SmGFP的根瘤农杆菌LBA4404 共培养，培育出了转基因的蝴蝶兰。经绿色荧光蛋白检测和Southern印迹，证实了再生植株中含cop基因和hpt基因。     

基因枪法和农杆菌介导的Bt抗虫基因转化芥蓝

以芥蓝品种小香菇为试材,分别采用基因枪法和农杆菌介导转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝中,并对两种转化方法进行了优化和比较。结果表明:基因枪法在轰击距离为6cm、轰击次数为1次时转化效率最高,为0.43%;农杆菌介导转化法以带子叶下胚轴为外植体、预培养2d、侵染10min、共培养2d、抑菌培养5d后转入筛选培养基为最佳参数,转化效率为0.37%。经PCR和PCR-Southern鉴定,基因枪法和农杆菌介导转化法均成功将目的基因导入芥蓝基因组中。经抗虫性表型鉴定,T_0代转基因芥蓝植株对甘蓝夜蛾幼虫的抗性高于非转基因植株。     

根癌农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立

以寒富苹果组培苗叶片为外植体,利用植物表达载体上含潮霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA2301)对影响寒富遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,寒富叶片对潮霉素反应敏感,在附加潮霉素的培养基上寒富叶片褐化较为严重。潮霉素和卡那霉素适宜的筛选质量浓度分别为4 mg.L-1和25 mg.L-1。农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立以MS+TDZ 2.0 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1培养基为叶片离体再生芽培养基。适宜的转化条件为:菌液浓度D 600nm=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8 min、共培养时间为3～4 d、推迟4 d进行筛选培养。抗性基因对转化效率具有明显的影响,EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96%)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58%)高出几乎50%,EHA105(pCAMBIA2301)的抗性芽再生率最高达1.87%。GUS组织化学染色和PCR鉴定结果表明本研究获得了寒富苹果转基因植株。     

农杆菌介导的Cas9基因转化金针菇的研究

将酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列(SpCas9序列,Addgene#43802)根据金针菇(Flammulina velutipes)的密码子偏好性进行优化,并构建FvCas9双元表达载体,利用农杆菌介导法转化金针菇单核体Dan3,经抗性培养基筛选以及潮霉素和Cas9基因PCR扩增验证,结果显示Cas9基因已经成功转入金针菇菌丝体中,转化率为6.84%。     

农杆菌介导ODREB2B基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种黄麻子和中薯3号脱毒微型薯为外植体,利用根癌农杆菌介导法,将来源于诸葛菜的抗逆相关转录因子ODREB2B基因导入马铃薯,并对遗传转化的影响因素进行优化。获得抗性植株黄麻子33株、中薯3号27株,经PCR-Southern杂交分析,两品种分别有16株和14株呈阳性,证明ODREB2B基因已整合到马铃薯基因组中。     

农杆菌介导TCS及RIP基因转化草莓的研究

采用农杆菌介导法,将TCS基因和RIP基因导入草莓中,探讨影响草莓遗传转化的主要因素,建立了高效的草莓遗传转化体系。并经Km抗性筛选,获得了若干转基因植株,对这些植株进行了TCS基因和RIP基因的PCR检测和PCR-Southern杂交检测,结果显示,TCS基因及RIP基因已转入草莓植株的基因组中。     

农杆菌介导PSAG12-IPT基因转化辣椒的研究

异戊烯基转移酶(Isopentenyl-Transferasas,IPT),也称作细胞分裂素合成酶,是植物中细胞分裂素合成的限速酶。IPT在转基因植株中超表达后,会使叶片中的细胞分裂素含量增加,从而延缓叶片衰老。但过高对植物的生长和育性都是有害的。如果将衰老特异性启动子(PSAG)与IPT基因融合,在它的驱动下表达,只有在叶片衰老时才表达合成分裂素,既能延缓衰老又不影响植物的生长发育。以p CAMBIA1301-PMI表达载体为基础载体,用衰老特异性启动子驱动目的基因IPT,用辣椒Flamingobill外植体作受体,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,并利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生物学检测和抗衰老检测。结果表明,共获得82株抗性植株,PCR检测的阳性率约为50%。而在对T1代的PCR检测表明该基因能稳定遗传给下一代。这些经转化的植株具有叶片衰老延缓及植株生命周期延长等现象,花的衰老也有所延缓。T1的株高和侧芽萌发与对照相比无明显差异。     

根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化

为建立优化的番茄外源基因转化体系,提高番茄的外源基因转化率,以番茄叶盘预培养时间和农杆菌与番茄叶盘的共培养温度、共培养时间为试验要素,摸索相对适宜的预培养及共培养的时间和温度范围,其余操作按常规步骤进行。结果表明:农杆菌与番茄叶盘的预培养适宜时间为27℃下32～48h;农杆菌与番茄叶盘的共培养的最适宜条件是:22～24℃下暗培养48h。