光照强度对海带配子体克隆生长的影响

本试验研究了在充气悬浮培养及静置培养条件下，不同光照强度对海带配子体克隆生长的影响。结果表明：在4500lx光照强度、充气悬浮培养条件下，海带配子体克隆具有较高的瞬时生长率。     

不同冷冻保护剂在猪精液冷冻中的作用分析

本实验采用一定浓度的甘油、EG、DMA、DMSO及其两两组合物作为冷冻保护剂。用含冷冻保护制的稀释液将精液稀释后,常温保存,观察精子活率,比较精子生存指数。结果表明：在常温下对精子毒害作用最大的是DMSO,其次是甘油,EG和DMA对精子毒害作用最小。以一定浓度的10种冷冻保护剂将对精液冷冻后观察解冻活率,发现EG和DMA混合保护剂解冻后精子活率最高。     

海带(Laminaria japonica Aresch)胚孢子萌发和配子体生长与光照波长间关系的研究

研究了紫外光和可见光谱内不同波长光及白光（全色光）与我国养殖海带（ＬａｍｉｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａＡｒｅｓｃｈ）胚孢子萌发和配子体生长之间的关系,结果发现：不同波长光照（３００～７００ｎｍ）对海带胚孢子的萌发率、萌发管的生长及雌、雄配子体的生长均有显著影响,其影响特点是因个体生长发育时期的不同而有所不同。试验还表明,在海带配子体世代,细胞内光合色素的功能随着个体的生长发育渐趋完全。     

海带配子体克隆育苗的关键技术

海带配子体克隆育苗生产技术工艺包括克隆的扩增培养、采苗及幼苗培育3部分。从生产应用的角度总结并探讨了海带克隆育苗工艺中各环节的关键技术。     

海水不同消毒方式对海带配子体克隆生长发育的影响

通过5种海水不同消毒方式对海带配子体克隆生长发育进行试验,结果表明:无论是静置还是充气条件下,煮沸海水培养的配子体克隆生长最快,盐酸消毒的海水次之,次氯酸钠消毒海水最差,紫外线消毒和臭氧介于其间。煮沸和紫外线消毒海水中的海带配子体克隆发育率较高,2者非常接近,盐酸消毒和臭氧消毒海水中的海带配子体克隆发育也较高,而次氯酸钠消毒海水中的海带配子体克隆发育非常缓慢。试验证明除煮沸消毒外,盐酸消毒海水可以用于海带配子体克隆扩大培养。     

铁离子对海带配子体克隆系生长发育的影响

为了探究Fe³⁺在不同氮、磷条件下对海带（）配子体生长发育的影响,以海带''黄官1号''雌、雄配子体克隆系为材料,以含有不同浓度的氮（N）、磷（P）营养盐的灭菌海水为培养液,添加不同浓度（0μmol/L、0.36 μmol/L、3.60 μmol/L、8.90 μmol/L、17.80 μmol/L）的铁离子（Fe³⁺）,通过测定光系统Ⅱ的最大荧光产量（）观察配子体营养生长状况,通过计算发育率（包括卵囊形成率、排卵率、幼苗形成率）观测配子体发育与生殖状况。结果显示,N、P浓度分别为0.825 mmol/L、0.0336 mmol/L的条件下,浓度为3.60 μmol/L的Fe³⁺对海带配子体营养生长阶段的促进作用最大;在不同N、P浓度条件下,Fe³⁺浓度为3.60~17.80 μmol/L时能够提高海带配子体的最大荧光产量,且各浓度组之间没有显著性差异（3+能够促进海带配子体由营养生长转向生殖生长,Fe³⁺浓度为3.60~17.80 μmol/L时可显著促进海带配子体的生殖生长,且各浓度组之间没有显著性差异（>0.05）;即使N、P浓度达到0.825 mmol/L、0.0336 mmol/L,在无铁条件下所有的海带配子体维持在营养生长状态;即使Fe³⁺浓度达到3.60 μmol/L,在N、P浓度0.007 mmol/L、0.0003 mmol/L条件下,大部分海带配子体（65%）维持在营养生长状态,虽然小部分海带配子体（35%）进入了生殖生长状态,但生殖生长明显滞后于实验中的其他各个N、P浓度组。本研究表明,铁和N、P营养盐对海带配子体的营养生长和生殖生长具有协同促进作用,铁是海带配子体由营养生长到发育成熟再到有性生殖过程中的关键因素;在添加适宜浓度的氮（0.275 mmol/L）、磷营养盐（0.0112 mmol/L）条件下,浓度为3.60 μmol/L的Fe³⁺对海带配子体的生长发育促进作用最大。该结果可为提高海带育苗效率提供理论依据。     

海带(Laminaria japonica Aresch)胚孢子萌发和配子体生长与光照波长间关系的研究

研究了紫外光和可见光谱内不同波长光及白光与我国养殖海带胚孢子萌发和配子体生长之间的关系。结果发现：不同波长光照对海带胚孢子的萌发率,萌发管的生长及雌,雄配子体的生长均有显著影响,其影响特点是因个体生长发育时期的不同而有所不同。试验还表明,在海带配子体世代,细胞内光合色素的功能随着个体的生长发育渐趋完全。     

重离子束辐射对海带配子体克隆的影响

利用12C重离子束对东方海洋种质库保存的8个海带配子体克隆系进行3次辐射试验,辐射剂量分别为10、20、40、50、60、80、120、160、200和240 Gy.结果表明,使海带配子体克隆细胞发生变化的最低辐射剂量为60 Gy,随着剂量的增大,细胞死亡增多,240 Gy辐射剂量下仅有一个克隆系存活;80 Gy辐射剂...     

不同pH和培养方式对海带配子体生长发育的影响

为了解决海带配子体人工高密度培养过程中因海水中游离CO₂减少及pH升高而导致生长受限的问题,本研究以海带’奔牛’(Sacchatina japonica)雌雄配子体为材料,以不用pH的富营养灭菌海水(10 mg/L N,1 mg/L P)为培养液,通过测量配子体长度,计算相对生长率,比较不同pH对配子体生长的影响,结果显示,pH(P<0.001)、性别(P=0.016<0.05)对海带’奔牛’配子体生长有显著影响,长期处在pH<7培养条件下的雌雄配子体相对生长率显著低于其他2组,雌配子体的相对生长率(4.61%)显著高于雄配子体(3.35%)。初始pH为7.0的处理组与对照组相比,雌雄配子体的相对生长率均无显著差异(P>0.05)。在此基础上,采用在通空气悬浮培养同时补充CO₂的方式进行配子体扩增培养,利用纯CO₂压力罐(出气量120 L/h),15 L培养液每2d补充CO₂ 1～2 min,培养液pH范围即可控制在7.0～8.4,以此排除pH对配子体生长不利影响,并避免频繁...     

不同封口方式对901杂交海带♂配子体的影响

传统的海带配子体种质资源保存是用锥形瓶保存,纸盖封口,但由于近些年来污染比较严重,所保存的海带配子体附着大量的细菌和各种杂藻,对克隆生长有很大的影响。为了更有效地保存海带种质资源,我们实验了三种不同的封口方式进行培养,探求其对克隆生长状态的影响。结果证明,最有效的封口方式为:滤纸膜的封口方式,不论是对配子体细胞状态,还是对克隆增殖都要好于其它方式。     

铁盐对海带雌配子体生长发育的影响

为探明铁盐对不同品种(系)以及相同品种(系)在不同生长条件下海带雌配子体的影响,通过添加不同质量浓度的Fe3+,对培养在低温弱光[(10.0±1.0)℃、2μmol/(m2·s),L]和高温强光[(15.0±1.0)℃、80μmol/(m2·s),H]条件下的901、韩国海带和连杂1号3个品种(系)海带雌配子体...     

海带cbbX基因序列特征及在雌、雄配子体之间的差异表达

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,分子量为45.26ku,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,它们的剪切位点都遵循GT-AG规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有差异。自编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的Walker ATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列...     

海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选

利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段,将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109,构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定,电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后,选取10个阳性克隆进行测序和序列分析,有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性,初步判断为新的基因序列,3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。     

不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同发育期胚胎为实验材料,研究了7种渗透性和5种非渗透性抗冻剂对牙鲆尾芽期和心跳期胚胎的毒性,同时对玻璃化液在不同胚胎发育期的毒性作用,以及玻璃化颗粒冷冻过程中,冷冻颗粒降温和解冻的时间进行了研究。结果表明,单一渗透性抗冻剂对牙鲆胚胎的毒性随着抗冻剂浓度的升高、平衡时间的延长而提高,其毒性由大到小依次为乙二醇(EG)、酒精(EtOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1,2-丙二醇(PG)。非渗透性抗冻剂中聚乙烯吡咯酮(PVP)对牙鲆尾芽期胚胎的毒性最强,其次是蔗糖和D果糖,葡聚糖和葡萄糖毒性最弱。在总体积分数一定的情况下,PG、MeOH与DMSO体积比为9∶6∶5的混合抗冻剂对牙鲆尾芽期胚胎毒性最低;各发育期胚胎经过玻璃化液平衡后,尾芽期以前胚胎的成活率随胚胎发育期逐渐升高,心跳期以后逐渐降低,尾芽期和心跳期成活率最高。含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温时间最短为15.09 s,解冻时间最短为6.22 s;而不含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温和解冻时间分别为(13.83±1.86)s和(7.20±0.90)s。将PG、MeOH与DMSO按体积比9∶6∶5配成总体积分数为35%的混合溶液,再添加5%的蔗糖配制成玻璃化液,采用此玻璃化颗粒冷冻方法对173粒牙鲆尾芽期至心跳期胚胎进行超低温冷冻保存,解冻后共获得4粒成活胚胎。     

抗冻剂对日本鳗鲡精子活力及运动时间的影响

利用精子稀释液(0.5%氯化钠+0.25%氯化钾+0.25%葡萄糖)分别配制4%、8%、12%、16%、20%、24%的二甲亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、1,2-丙二醇(1,2-Propanediol)、乙二醇(Ethyleneglycol)四种抗冻剂,对日本鳗鲡精子进行激活处理,观察记录精子在不同浓度抗冻剂中的活力和5种运动(激烈运动、快速运动、慢速运动、摆动、死亡)时间。结果表明:4%~24%的四种抗冻剂都可以激活日本鳗鲡精子,其中二甲亚砜浓度为12%时,精子活力最高,平均可达到78.3%;甘油浓度为8%时,精子活力最高,平均可达到72.8%;12%的1,2-丙二醇和乙二醇激活精子后,精子活力都可以达到最高,分别是47.6%和57.8%。日本鳗鲡精子在8%的二甲亚砜、8%的甘油、8%的1,2-丙二醇和8%的乙二醇中,激烈运动时间均为最长,分别为11.8 s、11.1 s、6.0 s和2.9 s;用8%的甘油、16%的二甲亚砜、16%的1,2-丙二醇和12%的乙二醇激活日本鳗鲡精子后,精子存活时间均最长,分别达到154.6 s、45 s、20 s和34 s。与其它几种抗冻剂相比,8%的甘油能显著延长日本鳗鲡精子的寿命。四种抗冻剂对日本鳗鲡精子都有一定的毒性作用,处理后精子的活力和寿命均降低。     

Physiological differences between gametophytes and sporophytes of five cultivar strains of Saccharina japonica

The demand for high‐yield cultivars of Saccharina japonica in farming areas calls for a practical and simple method to select desired parental plants for seed breeding. In this study, we evaluated PSII photosynthetic performance by measuring chlorophyll fluorescence and the nutrient uptake rate in both the micro‐gametophyte and macro‐young‐sporophyte in five native strains (S1, S2, S3, S4 and S5) of S. japonica with different morphological characteristics. We found significant differences in PSII photosynthetic parameters and nitrate uptake rates between the strains studied in both gametophytes and young sporophytes. Female gametophytes of all strains presented larger cell sizes than males (P < 0.05). Among all tested strains, S2 presented the largest cell sizes and highest levels of PSII photosynthetic parameters and nutrient uptake rates in female gametophytes and young sporophytes. In open sea cultivation, S2 presented the greatest width and largest fresh weight values but the lowest thickness among all strains studied. Correlation analysis further indicated that the algal fresh weight showed strong positive relationships with cell size (R² > 0.747), the PSII photosynthetic parameters of female gametophytes (R² > 0.689) and the nitrate uptake rate of young sporophytes (R² = 0.640). These findings are considered promising for the future seed breeding of renewable, high‐yield strains.     

海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。     

The development of a sperm cryopreservation protocol for winter flounder Pseudopleuronectes americanus (Walbaum): evaluation of cryoprotectants and diluents

Three cryoprotectants (dimethyl sulphoxide, propylene glycol and glycerol) and two diluents (sucrose based and saline based) were mixed (9 parts diluent–1 part cryoprotectant) factorially to produce six extenders that were tested to develop an effective sperm cryopreservation protocol for winter flounder Pseudopleuronectes americanus (Walbaum). Sperm were diluted 1:3 with each extender and frozen by flotation on liquid nitrogen before being submerged and stored for 30 days. Sperm left unfrozen in each extender for 20 min showed no toxic effects on motility. Extenders containing propylene glycol (PG) as cryoprotectant yielded higher post‐thaw sperm motilities than those containing dimethyl sulphoxide (DMSO) or glycerol. The sucrose‐based diluent performed better than the saline‐based diluent when DMSO was used as cryoprotectant, but there were no differences in post‐thaw motility between diluents for the other cryoprotectants. Activating sperm with ovarian fluid and sea water instead of sea water alone had no effect on post‐thaw motility. In fertilization trials, no differences were observed between any of the extenders and fresh milt when milt, eggs and sea water were left in contact for 1 h. When sperm were forced to compete for eggs by reducing contact time to 20 s, fertilization results followed those of sperm motility rates. Percentage hatch and morphology of larvae at hatching did not differ for eggs fertilized by cryopreserved and fresh sperm. This study represents the first reported successful attempt at cryopreserving winter flounder sperm and should improve gamete and broodstock management protocols for this species.     

不同培养与操作条件对海带配子体培养效果的影响

本文研究了不同培养操作条件对海带配子体培养效果的影响,结果如下:(1)培养瓶3种封口方式:封口膜(Parafilm)显著抑制配子体生长(P0.05),滤纸和滤纸膜无显著差异;(2)利用5种不同消毒方式处理的海水配制培养液:煮沸海水和抽滤煮沸海水试验组海带配子体团直径最大,两者之间差异不显著。抽滤煮沸双抗(青霉素+链霉素)海水、抽滤生海水和抽滤双抗生海水配子体团直径三者之间无显著差异,但均显著小于煮沸海水和抽滤煮沸海水试验组(P0.05),抽滤生海水和抽滤双抗生海水试验组出现明显染菌;(3)设置2种不同的环境条件放置培养箱:常规实验室和无菌室对海带配子体生长无显著影响;(4)设置3种操作环境下进行培养液更换:在无菌室超净台和常规实验室超净台更换培养液,海带配子体生长无显著差异,无染菌。在常规实验室实验台更换培养液试验组配子体生长显著低于无菌室超净台和常规实验室超净台试验组(P0.05),且染菌率超过60%。     

中国海区不同养殖品系海带与长海带之间的遗传关系

对中国海区海带(Laminaria japonica)不同栽培品系(种)及长海带(L.longissirna)的配子体无性繁殖系进行12个酶系统的同工酶检测,获得了31个基因位点,酶谱分析结果说明,来自同一株海带的雌、雄配子体无性繁殖系具有较高的遗传相似性,但“860”品系可能因杂合度大,导致该品系雌、雄配子体无性繁殖之间的遗传距离较远。对它们相应的亲本孢子体进行RAPD分析,30个随机引物共得到185个扩增位点,其中多态性位点76个,占41％。利用UPGMA对同工酶及RAPD所得到的遗传距离进行聚类分析,表明中国海区养殖海带的不同品系或品种之间的遗传相似性较大,而“烟杂1号”与长海带之间具有较近的亲缘关系。基于同工酶和RAPD图谱的结果推测,“烟杂1号”是一个新的杂交种,其母本可能是“荣杂1号”,而父本可能是长海带。