罗斯河病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank中收录的罗斯河病毒(RRV)基因序列,以其保守的E2基因为靶序列,设计并筛选出一套特异性LAMP引物;通过优化反应条件,最终建立了RRV RT-LAMP检测方法,并对其灵敏度、特异性进行了验证。结果显示:本方法对RNA样本的最低检测限可达10拷贝/25μL,而荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的灵敏度分别为10拷贝/25μL、100拷贝/25μL;其特异性良好,不与同属或相似病毒发生交叉反应。结果表明,本方法灵敏、特异、快速、便捷,可应用于我国虫媒病高发区的RRV筛查预警。     

口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

本研究依据已发表的FMDV保守基因区域RNA设计特异性引物,扩增目的RNA的6个区域,通过体系优化试验、敏感性试验和特异性试验建立了通用型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法。试验结果为:体系优化试验确定最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为60 min,最佳内、外引物比为1:12;应用本方法只能扩增出口蹄疫病毒,不能扩增出其他相关疫病病原;经测定试验所用FMDV核酸初始浓度为20.082μg/L,本方法可检出的最低浓度为在此基础上稀释2~(-3)×10~(-6)倍;应用所建立的方法检测相关疫苗样品,只有4种亚型口蹄疫疫苗有扩增曲线,其他样品均未扩增出任何曲线。     

口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立检测口蹄疫的快速实用分子生物学技术，本研究借助新兴的环介导等温扩增技术，建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法-体外等温扩增检测方法。设计了6条针对FMDV3D基因的8个位点的特异性引物，建立了一套从核酸抽提到检测仅需要75min的快速检测技术。所建立的检测方法灵敏，与实时荧光RT-PCR灵敏度相当；且具有特异性，对其他水泡性疾病痛原体检测均为阴性；而且简单，不需要复杂的仪器，常规水浴锅在63．5℃即可进行，肉眼可直接观察检测结果。该方法是适合基层和现场检测而无需送至中心实验室的快速灵敏实用的分子生物学检测方法。     

猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病毒均为阴性;灵敏度高,所建立的CSFV-RT-LAMP方法灵敏度为10-5,总RNA的检测阈值约为1pg;反应快速,整个扩增反应可在1h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法,可以满足基层检疫的需要。     

猪瘟病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

通过对GenBank中注册的CSFV序列进行比对分析,针对CSFV NPro/C基因中的保守区域,设计合成了一套RT-LAMP引物,应用含有Npro/C基因的阳性质粒株对RT-LAMP引物进行验证.在成功扩增出特异片段的基础上,用CSFV RNA优化RT-LAMP反应体系和条件,建立了CSFV的可视化RT-LAMP快速...     

小反刍兽疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)建立了小反刍兽疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据小反刍兽疫病毒N基因保守区域设计的LAMP引物能够在63℃恒温下,1小时内实现目的核酸的大量扩增,由于在检测前加入荧光指示试剂,检测结果可以直接用肉眼判断,避免了由于开盖检验带来的扩增产物污染导致的假阳性。该检测体系具有较高的特异性,只能特异性地检测目的病毒,与其他同属的病毒或类似病毒等无交叉反应;具有较高的检测灵敏度,比普通RT-PCR灵敏性高10倍,与荧光RT-PCR的灵敏度相当。     

禽呼肠病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

根据禽呼肠病毒(ARV)的S1基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,用Bst DNA聚合酶,在63.5℃恒温条件下进行扩增,扩增后加入SYBR GreenⅠ染料直接或在紫外灯下观察判定扩增结果。该方法可检测出ARV标准株和分离株,具有很好的特异性;最低能检测出1个拷贝的pMD18-T-S1阳性质粒,敏感性很高。该方法无需特殊仪器,简便,快速,适用于禽呼肠病毒的临床快速检测。     

鹅新城疫病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究拟建立一种能在基层实时、便捷诊断鹅新城疫病毒(goose Newcastle disease virus,GNDV)的检测方法。根据GenBank中公布的GNDVF基因的高度同源保守序列设计特异性引物,并在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂,建立可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,建立的方法能特异地检测出GNDV及NDV Lasota疫苗株,而小鹅瘟病毒(GPV)、禽流感病毒(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等其他病毒均为阴性。所建立的GNDV可视化RT-LAMP检测方法对RNA的最低检测限为10pg,反应过程不需PCR仪等复杂的仪器,50min即可完成反应,可经肉眼观察反应体系颜色判定结果。该方法特异性强、灵敏度高,且操作安全、简便、快捷,可满足基层筛查GNDV的需求。     

鹅新城疫病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究拟建立一种能在基层实时、便捷诊断鹅新城疫病毒（goose Newcastle disease virus,GNDV）的检测方法。根据GenBank中公布的GNDV F基因的高度同源保守序列设计特异性引物,并在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂,建立可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,建立的方法能特异地检测出GNDV及NDV Lasota疫苗株,而小鹅瘟病毒（GPV）、禽流感病毒（AIV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）等其他病毒均为阴性。所建立的GNDV可视化RT-LAMP检测方法对RNA的最低检测限为10 pg,反应过程不需PCR仪等复杂的仪器,50 min即可完成反应,可经肉眼观察反应体系颜色判定结果。该方法特异性强、灵敏度高,且操作安全、简便、快捷,可满足基层筛查GNDV的需求。     

草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的VP6基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,在63℃恒温条件下进行扩增,扩增后加入SYBRGreenI染料染料,可通过肉眼直接观察到颜色变化来判定扩增结果。该方法操作简便,不需要特殊仪器,适用于水产养殖临床上对草鱼呼肠孤病毒的快速诊断。     

传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法,用于快速检测传染性法氏囊病,从而评估禽类动物健康情况,试验针对传染性法氏囊病病毒VP3序列设计引物,优化反应时间、温度、体系等获取最佳反应参数,对建立的传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的灵敏度、颜色变化、特异性进行研究并应用该方法检测临床疑似病料。结果表明:传染性法氏囊病病毒在60℃75 min和80℃10 min条件下目标核酸区段大量扩增,以此条件成功建立针对鸡传染性法氏囊病病毒的RTLAMP检测方法;在模板浓度为994.9 ng/μL并进行10倍稀释的情况下,所建立的RT-LAMP检测方法具有极高的灵敏性,可以检测到99.49 fg/μL的样品,比RT-PCR方法的灵敏度高100倍左右;在RT-LAMP的检测结果中加入Gene Finder可使阳性结果变为绿色;该方法只有鸡传染性法氏囊病病毒发生反应,表现出良好的特异性;在临床疑似病料检测中,RT-LAMP检测方法的检出率高达93.75%,比RT-PCR检测方法高25.00%。说明试验建立的传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法具有简便、灵敏、快速、强异性高等优点,可用于临床鸡传染性法氏囊病病毒的快速检测。     

施马伦贝格病毒RT-LAMP检测方法的建立

通过对施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)及其同属各病毒基因序列进行比对分析,设计了针对SBV S基因节段的一组6条特异性引物,经优化建立了SBV RT-LAMP检测方法,可在63℃恒温条件下,于50min内完成目的序列扩增,通过染料法和琼脂糖凝胶电泳法观察结果,其灵敏度可达10TCID50,与荧光RT-PCR方法具有相同的敏感性。特异性试验显示,本方法与同属的沙门达病毒(Shamonda virus)会发生交叉反应,需借助沙门达病毒S基因节段上的一个特异性酶切位点Afl II进行酶切,实现两者的鉴别诊断。对103份临床样品的检测结果显示,本方法与荧光RT-PCR方法符合率为100%。本研究建立的RT-LAMP方法快速、简单、灵敏度高,不仅适用于实验室鉴定,还可应用于口岸、野外等的临床大规模监测。     

禽流感病毒通用型RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种禽流感病毒(AIV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AIV M基因4个不同区段的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AIV的RT-LAMP方法。结果表明,该方法对AIV H1~H16亚型的检测结果均为阳性,而对其他禽类病毒的扩增均为阴性,具有良好的特异性。对AIV的最低检测限为13.43 EID50/m L,灵敏度为普通一步RT-PCR的10倍;扩增反应可以在恒温水浴内60 min内完成;在反应体系中添加荧光染料后,肉眼即可判定检测结果。该检测方法与RT-PCR方法和荧光定量RT-PCR方法对临床样品检测的符合率均为81.8%。该方法能够简便、快速、灵敏、特异地检测AIV。     

非洲马瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立非洲马瘟病毒(AHSV)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,基于AHSV VP7基因保守序列,设计2对特异性扩增引物。通过对反应体系中各组分浓度,反应温度及时间的优化,建立了快速、灵敏的AHSV RT-LAMP检测方法,并对该方法特异性、灵敏度、重复性进行探索。结果表明,在63℃恒温下反应45min,便可进行高效率的特异性扩增。反应产物经琼脂糖凝胶电泳和染料可视化鉴定,能够快速有效检测AHSV。用建立的方法检测马属动物易感的4种疫病病原,结果均为阴性,证实具有较高的特异性。灵敏度是RT-PCR的1 000倍。建立了AHSV RT-LAMP检测方法,具有快速、特异、灵敏、操作简单、设备要求低的特点,适合用于现场AHSV快速检测。     

狂犬病病毒RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测狂犬病病毒的方法,根据Gen Bank已公布的狂犬病病毒核蛋白N基因序列,设计并合成一对特异性的引物,以兽用疫苗株HEP-Flury为阳性毒株建立了RT-PCR检测方法。对建立的RT-PCR方法做灵敏度、特异性、重复性及稳定性试验,结果显示该方法的灵敏度可以达到20 FFU/m L,可以将狂犬病病毒与犬瘟热病毒和犬细小病毒区别开来。该方法重复性好,稳定可靠。     

牛呼吸道合胞体病毒RT-LAMP检测方法的建立

牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是引起牛呼吸道疾病的一种病毒性病原体。本研究建立一种利用环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测BRSV的新的方法,针对BRSV N基因(GeneBank:AF054668.1)设计4对特异性LAMP引物,每组引物特异性识别靶基因序列上4个独立区域,利用扩增靶DNA的Bst2.0 DNA聚合酶,63℃恒温水浴50 min完成病毒检测,使用钙黄绿素检测荧光目视和琼脂糖凝胶电泳方法,同时对牛的其他主要病毒进行特异性检测,结果证明特异性好。该RT-LAMP检测方法的灵敏度达到BRSV模板稀释的10~(-6)倍,可成功检测到临床样本中的BRSV基因组,为BRSV的临床检测提供了一种快速的试验手段,更适合BRS的诊断和临床现场快速检测。     

猪传染性胃肠炎病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

通过对比猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)主要流行毒株的M基因序列,选择其高度保守的区域设计LAMP引物,以羟基萘酚蓝(HNB)为指示剂,建立了1种快速检测TGEV的可视化环介导等温扩增方法。结果显示,采用建立的方法在恒温水浴锅中约1 h即可完成检测;用该方法检测猪流行性腹泻病毒,猪轮状病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪细小病毒,猪圆环病毒,均不发生交叉反应;以pET-21b-M质粒为模板评价所建立方法的敏感性,最低检测限为3.7×10~3个拷贝,比普通PCR方法高2个数量级;在反应前向反应体系中加入HNB,反应结束后阳性反应管颜色从紫罗兰色变为天蓝色,阴性反应管颜色无变化,且阴阳性管颜色差异明显。用建立的方法对收集的42份临床腹泻样品进行检测,共检测到21份样品阳性。为快速检测TGEV提供方法。     

猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立和应用

为了研究检测猪瘟病毒(CSFV)的快速诊断方法,试验采用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)分别设计了6条针对CSFV5′端保守基因特异引物,经条件优化后建立猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法。结果表明:在63℃恒温条件下45 min就能很好地扩增出CSFV目的片段;RT-LAMP产物经XhoⅠ酶切确定产物即为目的片段;将CSFV和其他6株与CSFV同属的病毒进行RT-LAMP扩增,结果只有CSFV得到阳性结果,其他均为阴性,说明此方法的特异性强;RT-LAMP对CSFV的最低检测量为1×101个基因拷贝,是常规RT-PCR敏感度的100倍;用CSFVRT-LAMP法和RT-PCR检测方法分别对27份临床样本进行检测,结果证明CSFV RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果的符合率为92.6%。     

禽流感病毒RT-LAMP检测技术的建立

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)M基因序列,设计针对所有亚型AIV的通用检测引物,并对反应条件进行优化,建立了检测AIV的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)可视化检测方法。结果表明,建立的检测方法对禽流感病毒总RNA最小检出限为10fg,灵敏度为RT-PCR的1 000倍,能特异地检测出所有不同的HA亚型禽流感病毒,对其他禽呼吸道病原体无扩增反应;本方法快速,在常规水浴锅或金属恒温槽中50min就可完成,反应结束后不需开盖即可直接用肉眼根据反应液的颜色变化对结果进行判定。本研究建立的禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法具有操作简便、仪器设备要求简单、灵敏、快速、特异等优点,适合在基层进行AIV的快速早期筛检。