猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

吉林延边地区猪附红细胞体A1基因的克隆与原核表达

采用PCR方法扩增吉林延边地区猪附红细胞体A1基因片段,将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;分别构建A1重组pGEX-4T-1和PET-28-a表达质粒,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示:克隆的A1基因片段长1 044 bp,含有1个999 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸,与GenBank中A1基因序列(AM265536)的同源性为97%;表达的融合蛋白分子量分别为64 ku和40 ku,能被猪附红细胞体阳性血清识别。表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

猪源附红细胞体rnpB基因的克隆与序列比较

为了解猪源附红细胞体(Mycoplasma spp.)RNA酶P RNA(RNase P RNA,rnpB)基因序列变异状况,将实验室保存的经16S rRNA基因序列分析鉴定的53份猪源附红细胞体阳性DNA样品用于rnpB基因的扩增,扩增产物克隆至pMD18-T载体并进行序列测定。将获得的序列与GenBank登录的猪附红细胞体(Mycoplasma suis)德国分离株rnpB基因序列(登录号:EF523602)进行分析和比对,利用MEGA5.0软件构建系统发育树,并与16S rRNA判定结果进行比较。结果共得到42条猪附红细胞体rnpB基因和11条小附红细胞体(M.parvum)rnpB基因序列。猪附红细胞体上海分离株rnpB基因与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因之间的核苷酸序列相似性为98.1%~100.0%;小附红细胞体上海分离株rnpB基因与猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列的相似性为91.0%,与猪附红细胞体上海分离株rnpB基因序列相似性为90.0%~91.0%。系统进化分析显示猪附红细胞体rnpB基因与小附红细胞体rnpB基因分布在不同聚簇上,与16S rRNA基因序列鉴定结果一致。     

猪附红细胞体MSG1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体MSG1基因的遗传变异特点,从上海地区3个屠宰场采集自然感染附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA,根据GenBank已经发表的猪附红细胞体MSG1基因序列(登录号AM407404.1),设计引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果共获得了82条猪附红细胞体MSG1基因序列,序列长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸.同源性分析显示与GenBank中已经发表的猪附红细胞体MSG1基因核苷酸序列相似性为96.5％～98.3％,氨基酸的相似性为97.9％～99.1％0.MSG1基因核苷酸序列的系统进化分析表明,上海地区猪附红细胞体分离株与GenBank登录的德国54/96分离株序列的亲缘关系较远.     

表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG₁和IgG_2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG₁和IgG_2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4⁺和CD8⁺含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。     

猪附红细胞体膜蛋白OxaA基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪附红细胞体膜蛋白OxaA的结构及其在免疫保护中的功能,根据GenBank上发表的猪附红细胞体(猪支原体NC_015153.1)全基因组序列中膜蛋白OxaA基因,对猪附红细胞体膜蛋白OxaA基因进行PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果:PCR扩增基因全长840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank(NC_015153.1)中对应序列同源性为98%,测序结果已提交GenBank(登录号为JN247625);生物信息学软件分析表明,膜蛋白OxaA是稳定型亲水性的蛋白,柔性区域呈散在性分布,以α-螺旋为主,主要有3个抗原表位区域。     

猪附红细胞体MSG1部分基因片段的全基因合成及克隆表达

通过人工合成猪附红细胞体MSG1基因的编码序列,以提高目的基因在大肠杆菌中的高效表达。根据Gen-Bank注册的AM407404的544～942氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了12条寡核苷酸片段。用重叠区扩增法(PAS)全基因合成MSG1部分目的基因,克隆入pjet1.2/blunt载体。经测序证实正确后,构建原核表达载体pET-28c/MSG1,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得含重组表达质粒的转化子,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。测序、酶切鉴定等结果表明,表达载体构建成功,诱导表达后大约在16000的位置出现明显的蛋白条带。     

猪附红细胞体MSG1蛋白的表达和多克隆抗体的制备

本研究将附红细胞体的MSG1蛋白基因按大肠杆菌密码子偏嗜性改造后进行全基因人工合成,合成的基因连接入pBAD/HisB载体后导入大肠杆菌Top10感受态细胞中,进行MSG1诱导表达,确定诱导表达的最佳时间和最佳诱导剂浓度。对表达的蛋白应用His单抗进行了特异性鉴定,对鉴定后的蛋白应用Ni-NTA纯化试剂进行了不同条件下的蛋白纯化。试验结果表明,诱导蛋白的分子量在45 ku左右,加入0.2%的L-阿拉伯糖,诱导2 h后所表达的蛋白量最高。经Western-blot鉴定,该蛋白可以被His单抗特异性识别,经纯化后可以得到较高纯度的MSG1蛋白。表达的MSG1蛋白经纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot证明制备的抗体具有高度的特异性。MSG1蛋白的表达和多抗的制备可以为后续研究附红细胞体的吸附机制、致病机理,以及附红细胞体病的治疗等提供理论基础。     

猪附红细胞体的诊治

猪附红细胞体(又名红细胞胞子虫),寄生于血液中,附于红细胞表面或细胞里。是猪的一种热性、溶血性、散发为主的传染病。病原能使红细胞变性、红细胞变形、破坏,从而导致猪自身免疫溶血性贫血,血液凝固障碍,而引起出血、低血糖和酸中毒以及机体免疫抑制。     

猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪附红细胞体α-烯醇化酶的功能,根据GenBank中猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的DNA序列设计引物,以猪附红细胞体吉林株DNA为模板,进行PCR扩增,将该基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码393个氨基酸,与GenBank上登录的α-烯醇化酶序列核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为100%。蛋白质的分子理论值为42.4 ku,理论等电点为6.62。α-烯醇化酶二级结构以α螺旋为主,主要有6个抗原表位区域。系统进化分析显示,该基因与牛支原体的亲缘关系最近,与犬支原体亲缘关系最远。     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基，同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体，进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明，以RPMI1640与小牛血清按6：4比例混合，同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳，接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后24h生长达到高峰，感染率分别为40．2％和31．0％，而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

猪附红细胞体的诊断和治疗

2000年夏天北京某猪场发生以体温升高,可视粘膜苍白,贫血为特征的疾病。经流行病学、临床症状、微生物学检验诊断为猪附红细胞体病。     

猪附红细胞体ORF2的全基因合成、表达与鉴定

通过重叠区扩增法（PCR-based accurate synthesis,PAS）人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌（DE3）中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

猪附红细胞体的电镜学观察

对 1 2头不同程度附红细胞体感染猪的血液标本进行电镜学观察结果显示 ;扫描电镜 4 580倍下红细胞膜缺损凹陷 ,表面有大小不一链球状、杆状附红细胞体附着 ,被感染红细胞呈波浪形改变。透射电镜 1 2 0 0 0倍下观察 ,附红细胞体为一近似球形结构物 ,边缘密度较中间密度大 ,附着点有纤丝状物与红细胞相连     

猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断.     

猪附红细胞体Dot-ELISA检测方法的建立

本试验建立了一种检测猪附红细胞体抗体的Dot—ELISA方法，并确定了试验程序中最适抗原包被浓度、被检血清最适稀释度等工作条件。特异性和重复性试验结果表明，所建立的Dot—ELISA不与猪瘟等常见猪病阳性血清发生交叉反应，且稳定性高；用所建立的Dot—ELISA与IHA对70头份被检血清进行平行检测，阳性率分别为90％和60％；对20份阳性血清进行检测，Dot—ELISA和IHA平均抗体滴度分别为1：1012和1：160。表明所建立的Dot-ELISA是一种比较敏感、特异和稳定的血清学检测方法，能用于猪附红细胞体的抗体检测和疾病诊断。     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原，用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗．建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)检测方法。结果显示，用PPA-ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体，具有很高的敏感性和特异性，重复性良好．完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。