猪流行性腹泻病毒 COE 抗原表位的原核表达及鉴定

为更好地了解近年来仔猪流行性腹泻疫情,收集上海地区猪流行性腹泻病猪的临床样品,扩增猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因（COE 基因）,构建原核表达载体 pColdⅡ-COE,转化至大肠埃希菌 pG-Tf2／BL21,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 结果显示,表达的 COE 蛋白大小为16 ku,Western blot 分析表明,该蛋白与临床上猪流行性腹泻病毒阳性猪的血清有特异性反应,说明所表达的 COE 蛋白具有反应原性,为进一步研制猪流行性腹泻疫苗和 ELISA 检测方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验

通过RT-PCR和重组PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)疫苗株sM、M、S基因,构建重组腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与BJ5183细菌同源重组构建同源重组腺病毒质粒,同源重组腺病毒质粒经Pac Ⅰ酶切后转染AD-293细胞,获得3个含有目的基因的重组腺病毒。将3个具有感染能力的复制缺陷性重组腺病毒共同感染Vero细胞,细胞上清液进行小鼠免疫特性研究。结果表明,共同感染Vero细胞所得蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性

利用RT-PCR、同源重组等技术构建了含有猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因上3个片段的重组腺病毒质粒pAd-S98～638,pAd-S1～638,pAd-S49838～1384,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬宽纯化分别获得了重组腺病毒rAd-s498～638,rAd-S1～638,rAd-S498～1384.重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代效价稳定,TCID50分别为每毫升10-6.29、10-5.75、10-6.5.应用猪流行性腹泻病毒阳性血清进行间接免疫荧光抗体试验,在3个腺病毒感染的HEK-293A细胞的胞质见有清晰荧光.将3个重组腺病毒分别免疫小鼠,结果均诱导产生较强的体液免疫应答.结果表明这3个重组腺病毒对S基因的3个片段均可成功表达,并具有较好的免疫原性,为PEDV重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区的原核表达及鉴定

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)是引起猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原。尤其PED与猪传染性胃肠炎在流行病学、临床症状、病理剖检等变化上非常相似,给该病的快速诊断带来了一定困难。目前很多用于诊断PEDV的免疫学检测方法多以全病毒抗原或由其制备的抗体制剂为基础。而在生产实践中由于人工培养或提取大量PEDV的技术难度及经济成本均很高,因此极大地限制了利用天然PED病毒作为诊断试剂的应用。本研究的目的就是通过基因重组表达技术获得大量重组PEDVM蛋白进而将其应用于大规模…     

猪流行性腹泻病毒疫苗研究进展

猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种肠道传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失,目前尚无有效的治疗药物,接种疫苗仍是主要预防措施。自1971年首次发现PEDV以来,该病毒便不断发生变异并出现了大范围传播,有关PEDV疫苗的研究工作也在不断完善,但免疫效果并不理想。疫苗的安全性和有效性是疫苗研发的首要因素。传统灭活疫苗安全性好,但需多次大量接种;弱毒疫苗免疫原性强,但易毒力返祖;新型亚单位疫苗与灭活疫苗类似,保证抗原蛋白的天然构象、提高免疫原性是今后研发的重点;重组活载体疫苗中的载体本身就充当了“免疫增强剂”的角色,而另一方面,致弱后的载体能否稳定遗传及其安全性还需更深入的研究;面对变异速度极快的冠状病毒,第三代核酸疫苗只需简单修改相应基因即可迅速投入使用,而这类疫苗存在很大的缺口,未来需要侧重于核酸疫苗的研发;利用转基因植物生产疫苗可避免其他动物病原的污染,无需低温储存,植物细胞壁可对抗原蛋白进行保护,避免被酶消化,稳定性好,但这类疫苗在进...     

猪流行性腹泻病毒基因及疫苗的研究进展

在生猪的养殖过程中,猪流行性腹泻一旦发生会造成较为严重的经济损失。本文主要对猪流行性腹泻病毒的基因结构和当前猪流行性腹泻疫苗的研究进展进行了介绍,希望能为猪流行性腹泻的科学防控提供参考。     

猪流行性腹泻病毒COE蛋白的原核表达及免疫原性分析

为表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原表位COE蛋白,分析其免疫原性,为PEDV的检测和亚单位疫苗的开发奠定基础.参考GenBank中PEDV COE基因序列,人工合成并经生物信息学综合分析后,将合成的基因片段插入原核表达载体pET-32a(+),构建...     

流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因导入甲病毒载体(plasmid Semliki ForestViru,pSFV) ,研究该基因及其编码蛋白的表达。首先将扩增的病毒M 基因导入pSFV的SP6 启动子下游。用Spe Ⅰ酶将pSFV M重组质粒DNA 线性化,再将其体外转录成5′末端含帽子结构的重组RNA。然后通过电穿孔法将此重组RNA转染BHK 21 细胞,收集病毒样粒子用于感染BHK 21 细胞。采用细胞免疫化学的方法对转染和感染细胞的表达产物进行分析。pSFV M RNA 转染和病毒粒子感染哺乳动物细胞表达的M 蛋白,可与PEDV多克隆抗体起特异反应,证明体外转录的重组RNA 含有PEDV M的特异序列。     

猪流行性腹泻病毒M基因的表达及鉴定

为了更好的研究近两年在我国爆发的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)疫情,本实验室收集不同发病地区的临床样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)RT-PCR检测,并挑选8个阳性样品对其M基因进行扩增,克隆和测序。序列比对的结果显示,8个分离株与14个参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是96.5%～99.9%和96.0%～100%,表明目前流行的PEDV其M基因是相对保守的。同时,我们将ZZ-1株的M基因克隆于原核载体pGEX-6p-1,转入菌株BL21中后获得了大量表达,重组蛋白大小约为50 kDa。利用PEDV阳性猪血清对纯化后的重组M蛋白进行Western blot分析,结果表明重组表达的M蛋白与临床阳性猪血清具有良好的免疫反应性。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定

目的:讨论猪流行性腹泻病毒的分离鉴定。方法:选取大型猪场中疑似猪流行性腹泻病死的仔猪的肠道内容物制成标本进行分离,RNA提取,反转录,RT-PCR,小白鼠感受性试验。结果:使用胰酶检测细胞的毒性,结果50μg/ml以下的胰酶含量对细胞没有毒性。经过RT-PCR检测确定病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。在小白鼠感受性试验中,小白鼠没有死亡,将其内脏解剖后,没有确定的变化。结论:经过分离达到病毒PEDV,在诊断中使用RT-PCR检测确诊可行。     

猪流行性腹泻病病毒的分离鉴定

猪流行性腹泻病,是造成养猪业经济损失严重的传染病之一。本文是针对某养猪场的病死猪进行临床症状观察、病理剖检,通过病毒的分离培养及RT-PCR鉴定,确诊病死猪病原为猪流行性腹泻病毒应加强对猪流行性腹泻病的诊断及监控。     

猪流行性腹泻病毒SZ株的分离与鉴定

从资阳某猪场发生腹泻症状的猪肠道内容物中分离得到一株病毒,经荧光检测、RT-PCR检测及序列分析鉴定后,证实该分离株为猪流行性腹泻病毒,命名为SZ株。PCR方法克隆S基因的部分片段,序列分析结果表明PCR扩增的部分S基因与其他毒株比对,结果表明与CH/XJUrumqi及韩国AF500215 S1的亲缘关系较近。     

猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定

从广州某猪场采集疑为病毒性腹泻的病猪粪便，除菌处理后接种PK—15传代细胞，采用在接种物和细胞维持波中加入60μg/mL胰蛋白酶的方法，分离到一株野毒。中和试验、动物回归试验和电镜观察结果表明，分离的病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。     

Construction and Immunogenicity of Recombinant Lactococcus lactis Expressing S1 Protein of Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)

To evaluate the specific immune responses induced by recombinant Lactococcus lactis(L.lactis) which expresses porcine epidemic diarrhea virus(PEDV) S1 protein through oral administration,the spike gene fragment of PEDV was amplified from PEDV SDLY strain to construct p MG36 e-S1 recombinant plasmid.The recombinant plasmid was then electro-transferred into competent cells of L.lactis MG1363,to prepare the recombinant L.lactis expressing S1 protein of PEDV.The expression of target protein was identified by SDS-PAGE and Western-blot.New Zealand white rabbits were orally administered with the recombinant strain;the antibody titer in intestinal mucosa and serum was detected by neutralizing test;and the specific Ig G in serum was evaluated by indirect ELISA.The results showed that the recombinant L.lactis could effectively induce high level of Ig G in serum and high level of mucosal immune antibody.The recombinant L.lactis is qualified to be a potential oral vaccine because it could successfully stimulate both humoral and mucosal immune responses against PEDV.     

猪流行性腹泻病毒SD株的分离与鉴定

利用Vero细胞自安徽合肥腹泻仔猪小肠内容物中分离到一株病毒,经胶体金、PCR方法和攻毒试验,确定为猪流行性腹泻病毒,命名为SD株。SD株在Vero细胞上传代,第8代(F8)开始出现稳定的细胞病变(CPE),F8代的毒价(TCID50)为10-6.25/0.1 m L,F8代细胞培养物接种未吃初乳仔猪,接种仔猪均出现典型腹泻症状,死亡仔猪3头(50%),未死亡猪生长严重发育不良,说明SD株具有较强的致病性。     

猪流行性腹泻病毒陕西HZ株的分离与鉴定

从陕西省某养猪场送检的腹泻仔猪小肠内容物中分离到1株病毒,用Vero细胞盲传至8代以后出现较为稳定的CPE,经理化特性检测、TCID50测定、RT-PCR鉴定及序列比对,最终确定该分离毒株为流行性腹泻病毒(PEDV),将其命名为PEDV HZ株。以分离株RNA为模板,经RT-PCR扩增出大小为681bp和1 326bp的M基因和N基因,并与其他国内外分离株的相应基因进行比较,结果显示,PEDV HZ株与其他国内外分离株的M基因和N基因核苷酸序列的同源性分别为98.1%~100%和93.9%~100%,氨基酸序列的同源性分别为96.9%~99.6%和93.0%~100%,遗传进化树分析显示,PEDV HZ株与中国株CHGD-01处于同一个进化分支,亲缘关系最近。     

猪流行性腹泻病毒SDbz株的分离与鉴定

取病死仔猪十二指肠、空肠及肠内容物制成匀浆,应用套式RT-PCR检测呈现猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性,经处理将其接种到含终浓度50μg/mL胰酶的Vero细胞上进行病毒分离传代,盲传到10代左右开始出现局灶性细胞病变(CPE),20代以后特征性CPE稳定出现。将病毒Vero细胞培养物应用毒价测定及病毒中和试验、套式RT-PCR和间接免疫荧光进行检测鉴定,证明所分离到的病毒为PEDV,并将其命名为PEDVSDbz株。     

表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定

为探索猪痘病毒（swinepox virus,SWPV）作为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。     

猪流行性腹泻病毒变异株的鉴定和分子特征分析

为查明山东省某猪场流行性腹泻的病因,本研究对该猪场病死仔猪进行病理学检查,并对采集的7份仔猪腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)的套式RT-PCR检测。病理学检查发现病猪的肠道肿胀、变薄、出血,肠绒毛皱缩、变短、边缘粗糙。套式RT-PCR结果显示,7份样品均为PEDV阳性;对其中两份PEDV阳性病料进行S基因扩增,分析其遗传变异,结果显示这两株PEDV野毒株的S基因与参考疫苗株CV777的同源性为92.3%~92.4%,与其他野毒株的同源性为96.6%~98.6%。PEDV的遗传进化树结果显示,PEDV分为两个进化分支G1和G2,G1包括CV777等疫苗株及中国和韩国早期的部分毒株,G2则是PEDV变异株为主的分支,包括本试验分离的野毒株及近年来美国、中国等国的野毒株,这些毒株都存在两个插入突变和1个缺失突变。结果表明,变异株已成为PEDV的流行优势毒株,且这些变异位点有可能成为鉴定PEDV变异株的分子特征。     

Identification and Molecular Characteristics Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variants

To ascertain a diarrhea case in a pig farm in Shandong province,the pathological changes of dead piglets were observed and nested RT-PCR test was carried out on 7 diarrhea samples for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).Pathological examination revealed that intestine was detected as enlargement,hyperemia and edema.After histological examination,the typical microscopic lesions of intestine were disappearance of epithelial cells,villus shrinkage and shortening.The result of nested RT-PCR showed that all of the 7 samples could amplify a specific target band of PEDV.Molecular characteristics of two field strains showed that they had an amino acid homology of 92.3% to 92.4% with vaccine CV777 and 96.6% to 98.6% with other previous field strains which sequences were downloaded from GenBank.Phylogenetic tree analysis further revealed that all of PEDV strains could be mainly divided into two clusters of G1 and G2. G2 consisted of the field strains of our study and other field strains from USA,China and so on,which had the same sequence characteristics of two insertions and one deletion,while G1 consisted of all vaccines of CV777 and several older field strains from China and Korea.These results indicated that our field strains were the dominant strains in recent epidemic diarrhea occurrence.Moreover,its molecular characteristics might be a characterization of differentiating the field and vaccine strains.