米曲霉原生质体生成条件的研究

[目的]探讨米曲霉原生质体制备的高效方法.[方法]统计米曲霉菌丝体检测不同生长时间(72、84、96、108、120 h)的菌丝、不同渗透压(分别使用0.8 mol/L蔗糖、氯化钠和葡萄糖溶液作为渗透压稳定剂)和不同组合酶系(溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶、混合酶系的配比按照L9(34)正交设计)下的原生质体产量.[结果]经检测,培养108 h菌丝体、0.8 mol/L NaCl渗透压稳定剂原生质体产量较高.同时溶菌酶(2 mg/ml)+纤维素酶(6 mg/ml)+蜗牛酶(6 mg/ml)组合酶系原生质体产量较高,达9×105个/ml.[结论]原生质体的产量受菌体自身状况和外界条件影响.该研究为大量制备高活力的原生质体及进行细胞融合试验奠定了基础.     

NTG和UV复合诱变米曲霉原生质体选育米蛋白分解菌的研究

以米曲霉（Ａ．ｏ－２）原生质体为对象，采用ＮＴＧ和ＵＶ作为诱变剂进行单因子和多因子复合诱变处理，在以米渣为主要原料的固体培养基上培养，选育出中性蛋白酶活力较高、生长快、易于培养的变异株Ｎ－４。在原料配比为米渣：麦麸＝２：１、培养时间为４８ｈ、培养温度为３０℃的培养条件下，变异株Ｎ－４的中性蛋白酶活力最高，比出发菌株Ａ．ｏ－２提高３２．６％。     

原生质体诱变提高米曲霉产纤维素酶活力的研究

利用紫外线对米曲霉原生质体进行诱变，获得1株高产纤维素酶的3号突变株，其纤维素酶活较出发株提高了2.49倍，同时研究表明，无机盐MgSO4和（NH4）2SO4对3号菌株产纤维素酶有促进作用     

米曲霉生产曲酸的发酵条件研究

【目的】优化米曲霉生产曲酸的发酵条件,提高生产效率,对米曲霉(Aspergillus oryzae)GIM3.423生产曲酸的发酵条件进行研究。【方法】采用单因素试验对摇瓶发酵条件进行优化。【结果】发酵液pH、发酵温度、装液量、摇床转速、接种量等因素影响和制约整个发酵过程,发酵温度30℃,装液量60ml/250ml,摇床转速200rpm,种龄6h,接种量10%,发酵周期控制在13d条件下,曲酸生产的转化率可达23.6%,。【结论】摇瓶发酵最佳条件为发酵温度30℃,装液量60ml/250ml,摇床转速200rpm,种龄6h,接种量10%,发酵周期控制在13d。     

平菇原生质体制备条件的研究

从综合酶种类、酶浓度、菌龄、酶解温度、酶解时间及稳渗剂等方面,探讨平菇原生质体制备的条件。     

米曲霉B60菌株的酶学性质研究

以猪血为底物,对米曲霉所产蛋白酶的酶学性质进行研究,以进一步提高米曲霉B60发酵猪血的性能,为其在生产上的应用提供理论支持。结果表明：用硫酸铵沉降法所得粗酶粉的中性蛋白酶酶活力高达166 857.13U/g,碱性蛋白酶酶活力为13 142.857U/g;该酶酶解猪血的最佳加酶量为0.4g,最佳酶解时间为8h,最适酶解温度为40℃,最适酶解pH值为10。     

一株米曲霉产纤维素酶条件的优化

以一株实验室保存的米曲霉M1102为出发菌株,研究固态环境中碳源、氮源、初始p H值、含水量、培养温度、培养时间等因素对米曲霉产纤维素酶活力的影响。结果表明:当碳源为麸皮,氮源为豆饼粉,初始p H值为6.5,含水量为50%,培养温度为30℃,培养时间为60 h时,米曲霉产纤维素酶活力最高。     

米曲霉固态发酵豆粕产蛋白酶条件的研究

通过单因素(温度、豆粕含量、发酵时间)试验和3因素3水平正交试验,以蛋白酶活为测定指标,对米曲霉固态发酵豆粕产蛋白酶条件进行研究,结果表明:米曲霉固态发酵豆粕产蛋白酶最优条件是发酵温度30℃,发酵时间66 h,豆粕含量93%,此条件下的酶活为572.85 U/g。     

金线莲原生质体游离的研究

采用生物化学的方法对兰科药用植物金线莲Anoectochilus formosanus Hayata原生质体的分离进行了试验探讨.结果表明，从金线莲叶片组织分离原生质体的效率很高，以含有ω=1％的Macerozyme R-10和ω=2％的Cellurase ONOZUKA R-10的酶解溶液进行5-6h的处理，可以从1g鲜质量的嫩叶材料得到820万个以上的原生质体．     

饲料用米曲霉酸性蛋白酶研究

[目的]研究米曲霉酸性蛋白酶的纯化技术以及催化特性,为米曲霉酸性蛋白酶的开发和利用提供理论依据。[方法]采用丙酮沉淀,DEAE—Sephadex A-50柱层析方法分离纯化了米曲霉酸性蛋白酶,以酪蛋白为底物对其酶学性质进行了研究：[结果]结果表明：纯化倍数达到20．77;该酶最适pH值为6．0,最适温度为45℃;Fe^2＋、Mg^2＋对该蛋白酶的活性有明显的抑制作用,而Mn^2＋、Cu^2＋对该蛋白酶的活性有明显的激活作用。该蛋白酶Km=4．704mg/ml,Vmax=22．27μg／min。[结论]米曲霉蛋白酶具有很好的应用前景。     

酶解条件对黄瓜原生质体分离效果的影响

[目的]研究黄瓜原生质体分离的最佳酶解条件.[方法]以黄瓜子叶和悬浮细胞为材料,研究不同酶解条件对其原生质体的分离效果的影响.[结果]黄瓜子叶获得高质量的原生质体的最佳条件为：酶液组合2％纤维素酶＋1.0％果胶酶,酶解时间8h,酶液浓度0.7 mol/L,酶液pH 5.5.[结论]该试验研究了不同酶解条件对黄瓜原生质体的分离效果的影响,为黄瓜的进一步开发利用提供依据.     

利用原生质体融合技术构建梨孢属融合子的研究方法初探

鉴于有性世代形成能高的稻瘟病菌菌株有限,稻瘟病菌间的杂交组合难于获得,从而很难对一些重要基因,如无毒基因,抗药性基因等进行遗传分析及深入研究.本研究利用原生质体融合技术获得梨孢菌的杂合子,从而评价该体系用于遗传研究的可行性.首先,利用转基因技术获得稻瘟病菌Y93-164a-1跟蟋蟀草病菌SA98-4的抗药性转化子,然后将两个菌的稳定转化子的原生质体进行融合,之后进行连续5次的继代培养,最后进行3次单孢分离来挑选稳定的融合子.结果表明,利用原生质体融合技术在两个不同致病型的梨孢菌之间能获得稳定的融合子,初步表明利用原生质体融合技术组建梨孢菌的融合子群体用于遗传分析在技术上是可行的.

Abstract：

The genetic analysis of important genes, e. g. avirulence genes, antibiotic resistant genes in Magnaporthe oryzae pathogens had been limited because of the difficulty of getting highly fertile strains for genetic cross, especially in Oryza pathotype strains. In the present study, an alternative method for the genetic study of this fungus was tried by using the protoplast fusion system. Firstly, drug-resistant transformants were generated from the Oryza strain Y93-164a-1 and Eleusine pathotype strain SA98-4, then protoplasts of both selected transformants were fused by protoplast fusion technique. Stable fusants were selected after at least five subcultures and three single-spored isolations on the selective medium. Results suggested that the stable fusants can be easily obtained by protoplast fusion system, showing the protoplast fusion system could be usable for genetic analysis of M. oryzae pathogens.     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

石斛兰叶片原生质体分离条件研究

[目的]探讨了石斛兰原生质体分离过程中的影响因素,建立最佳的原生质体制备体系。[方法]以石斛兰叶片为材料,采用正交设计研究纤维素酶浓度、酶解时间、温度、pH值以及甘露醇浓度对石斛兰原生质体分离的影响。[结果]以3%纤维素酶R-10＋0.6%果胶酶Y-23为混合酶液,0.5mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,在26℃的黑暗条件下,pH值为5.4的酶液组合中,黑暗条件下振荡,酶解15h,获得的原生质体产量最高。[结论]该制备体系为后续原生质体培养和体细胞杂交奠定良好的基础。     

绿色木霉原生质体形成条件的研究

研究了绿色木霉F264(Trichoderma viride pers)的原生质体形成条件。结果表明,制备原生质体的最佳条件为:菌丝菌龄为18～20h,用溶菌酶:蜗牛酶=3∶3(mg/ml)的混合酶,以0.6 mol/LNaCl渗透压稳定剂的磷酸缓冲系统最好,在32℃酶解3h,原生质体产量最为理想。     

泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化

[目的]探讨泰妙菌素生产菌种原生质体的最优制备方法。[方法]通过对原生质体制备条件进行优化,建立泰妙生产菌种原生质体制备体系。[结果]优化后制备条件:以培养3 d的菌丝体为材料,将其置于含质量浓度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO_4的酶液中,25℃酶解3.0~3.5 h,将酶解液用G2砂芯漏斗过滤,滤液即为原生质体悬液。采用该方法,泰妙生产菌种原生质体制备率达1.5×10~6个/m L。[结论]试验结果为提高泰妙菌素生产菌种的产量提供了理论依据。     

茶薪菇原生质体制备条件的分析

以茶薪菇为出发菌株,对其原生质体制备条件进行研究,具体分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解时间和温度等因素对茶薪菇原生质体产出量的影响。结果表明:采用液体发酵培养第5 d的菌丝体,以0.4 mol/L KC l作渗透压稳定剂,加入0.20%混合酶(纤维素酶与蜗牛酶按1∶1混合)在25℃下酶解3 h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达2.5×107个/mL。     

聚乙二醇法诱导烟草原生质体融合的条件优化

采用聚乙二醇(PEG)法诱导烟草原生质体融合,对融合时PEG的浓度、用量、融合时间及融合温度进行优化,以期得到一种融合率较高的方法。结果表明:以40%的PEG融合的二元融合率最高;PEG与原生质体悬浮液体积比为3∶5,在0.5～0.6 mol/L甘露醇为渗透压时,25～30℃下融合20～25 min的融合效果最佳,融合率始终保持在20%左右,甚至可达25%。