Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力.结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5％新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长.然而在1％新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长.经过在该1％血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松.由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好.比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变.     

Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究

通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID₅₀间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×10⁶ mL^-1。     

粘虫胚胎细胞继代培养条件的研究

对粘虫胚胎细胞的继代培养条件进行了研究。结果表明,ＴＣ－１００（ＳＩＧＭＡ）培养基最适合细胞生长。不同血清浓度和ｐＨ的培养基对细胞生长影响很大,以１０％小牛血清浓度和ｐＨ６．２的培养基对细胞传代培养最为适宜。细胞生长依赖于细胞接种密度,以 ５×１０~５细胞／ｍＬ细胞接种密度对细胞生长最为适宜。适于细胞培养的最适温度范围是２６－２９℃。     

纳豆菌生物学特性研究

研究了不同温度、pH值、培养时间、通气量、接种量、盐浓度因素对纳豆菌生长的影响，试验结果表明，该菌种生长适宜条件为：温度30-45℃；通风，转速140r／min，500mL三角瓶装液量100mL；pH值7．0；培养时间24h；接种量2％-5％。纳豆菌耐盐性较强，在含盐量8％的条件下仍能较好生长。     

PRRSV青海株与其他疫苗株对Marc-145细胞的毒力比较

[目的]研究青海PRRSV毒株对Marc-145细胞的适应性和增殖速率以及致病性和毒力等.[方法]以PRRSV青海毒株QH08、海利和诺倍威CH-1R经典毒株、GW-HR毒株及其在Marc-145细胞上的传代毒株为研究对象,对4种毒株及其传代毒株的TCID50值和细胞病变作用(CPE)出现的时间进行比较,探讨了PRRSV青海毒株对Marc-145细胞的适应性、在Marc-145细胞内的增殖速率以及该毒株的毒力.[结果]随着PRRSV传代次数的增加,病毒在Marc-145细胞中的增殖速率加快,对细胞的适应性和毒力都增强.与其他3个毒株相比,青海株毒力最强;C PE出现的时间提前,说明病毒在Marc-145细胞中的复制周期缩短,表明不同毒株PRRSV的F10比F1在Marc-145细胞中具备更好的复制能力和致病性.[结论]4株PRRSV传代毒10个代次的TCID50总趋势为渐变上调的趋势,CPE出现的时间总体上呈逐渐缩短的趋势.     

生物反应器中PRRSV工业规模增殖工艺的建立

分析比较了3种不同微载体悬浮培养工艺——分批换液式、消化传代放大式、循环灌注培养式对Marc-145细胞微载体培养效能及生理代谢的特点及差异,并实现了从5 L至60 L反应器放大过程的PRRSV实际增殖应用。结果表明,在5 L动物细胞反应器中使用相同的微载体用量6 g/L,分批换液式培养和消化传代放大式培养仅获得27×105~28×105cells/m L的细胞密度,低于循环灌注培养式的培养能力(59.4×105cells/m L)。根据这3种不同培养工艺的特点,设计并实施了可应用于实际生产的工艺流程,即Marc-145种子细胞以循环灌注培养方式在5 L反应器中完成初级培养,经消化传代工艺,将种子细胞放大接种于60 L反应器中进行分批换液式的二级培养,用于PRRSV的大规模增殖,结果显示PRRSV增殖滴度可达到108.3TCID50/m L。该过程成功地模拟了Marc-145细胞在工业级水平上的放大培养操作工艺,其放大倍数达到1∶3的传代系数,具备实际应用价值。     

Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

为确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。将PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上增殖,以半数细胞感染剂量为检测指标,对病毒维持液中血清浓度、接毒时间、感染复数(MOI)和收毒时间进行优化。结果表明,细胞培养后72 h接种病毒,病毒维持液中血清含量为2%,病毒感染复数为0.05,病毒感染48 h后PRRSV效价较高达到10~(6.6)TCID_(50)·mL~(-1),确定了PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上的增殖条件。     

葡萄糖对JAL1*杂交瘤细胞生长代谢的影响

研究了不同浓度的葡萄糖对JAL1杂交瘤细胞生长、乳酸及氨的生成等代谢过程的影响。在细胞培养箱中，批培养杂交瘤细胞，培养条件为pH7.0-7.5，温度37℃，5%CO2。结果表明，适宜于该株杂交瘤细胞生长的葡萄糖浓度为加入2－8g/L，所获得的单抗OD405值均在0．6以上，葡萄糖浓度对乳酸、氨积累的影响不大。     

金针菇液体发酵条件初探

[目的]为金针菇的开发利用提供依据．[方法]以金针菇菌种为材料,根据菌丝干重,对影响其生长的因素（碳源、氮源、培养基配方、培养温度、培养基初始pH值、摇床转速、培养时间）进行筛选。[结果]不同碳源对金针菇菌丝生长的影响为玉米粉〉淀粉〉绵白糖〉葡萄糖．2％牛肉膏作为氮源的效果较好。23℃时金针菇茵丝生长较好。培养基初始pH值为6．5时,金针菇菌丝的生长最好。摇床转速以140r／min为宜。振荡培养7d,金针菇菌丝生长量最大。[结论]金针菇适宜的液体培养基为：3％玉米粉,8％牛肉膏,2ml／L维生素母液500倍液,0．1％KH2PO4,0．5％MgSO4;适宜摇瓶的培养条件为：培养基初始pH值为6．5,在23℃,140r／min转速下,振荡培养7d。     

蛹虫草发酵菌丝体培养条件研究

[目的]对蛹虫草菌丝生长条件进行优化,为发酵工业中液体深层发酵生产蛹虫草的药用有效成分提供参考。[方法]通过单因素试验,改变碳源、氮源、接种菌龄、培养基起始pH、培养周期、培养温度、摇床速度、接种量和装液量来确定蛹虫草菌丝生长最佳条件。[结果]最佳发酵条件为：碳源为蔗糖,浓度为2％,氮源为蛋白胨,浓度为1％,接种菌龄为36h,培养基起始pH值为6．5,培养周期为6d,培养温度为24℃,摇床速度为200r／min,在250ml锥形瓶中的装液量为150ml;在此条件下,菌丝体干重最大。[结论]该方法获得了蛹虫草C-7发酵菌丝体的最佳培养条件,为蛹虫草的进一步开发利用提供依据。     

猪繁殖—呼吸综合征病毒上海分离株的病毒特性研究

对猪繁殖－呼吸综合征病毒（PRRSV）上海分离株（SH1）的理化特性和结构蛋白进行研究。结果表明，SH1分离株能致Marc-145细胞典型病变，TCID50为10^5.0mL^-1。对氯仿和乙醚、酸（pH5．5以下）、碱（pH8以上）、热（水浴56℃10min以上、37℃24h以上、28℃48h以上）均敏感。病毒负染可见以具囊膜的球形为主，囊膜上有纤突，大小为60－85nm。超薄切片可见病毒存在于细胞浆中。SH1分离株的病毒培养液经差速离心和非线性蔗糖密度梯度纯化，SDS－PAGE显示病毒结构蛋白的相对分子质量24000，19500，16000。免疫转印可见3条结构蛋白均能被PRRSV美洲株高免血清识别。     

pH和温度对黄姑鱼主要消化酶活力的影响

采用酶学分析的方法,研究了在不同pH和温度下离体黄姑鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性变化。结果表明：pH和温度对黄姑鱼主要消化道各部位消化酶活力多数有显著影响（P〈0.05）,在黄姑鱼前肠、中肠、后肠、胃、肝胰脏5个部位,蛋白酶的最适pH分别为6.4、7.8、7.8、2.2、6.4,淀粉酶最适pH分别为5.0、7.8、7.8、6.4、5.0,脂肪酶的最适pH分别为5.0、6.4、7.8、3.6、5.0;在最适pH条件下,前肠、中肠、后肠、胃、肝胰脏中蛋白酶的最适温度均为40℃左右,淀粉酶的最适温度除肝胰脏中为40℃外,其他部位均为30℃,脂肪酶的最适温度均为40℃。蛋白酶活力在pH 6.4、37℃时达到最大值1 606.576±83.457 U,淀粉酶活性在pH 6.4、37℃时达到最大值188.086±17.538 U,脂肪酶在pH 5.0、40℃时达到最大值34.247±1.926 U。     

培养基及培养条件对核桃试管芽苗继代增殖的影响

针对核桃试管芽苗继代培养玻璃化现象严重、试管芽苗易黄化或老化、继代增殖率低等问题, 本试验在固体培养条件下, 研究了不同培养基、pH值、培养温度及继代间隔时间等因子对核桃试管芽苗继代培养的影响。结果表明: ①新改良DKW培养基上的核桃试管芽苗较改良DKW培养基生长健壮, 增殖率高; ②核桃试管芽苗继代增殖的最适pH值为6 .2; ③变温培养(光照期25℃±3℃, 黑暗期18℃±2℃) 较恒温培养(25℃±3℃) 适于核桃试管芽苗的继代增殖; ④继代培养间隔20d, 试管芽苗生长健壮, 萌发新梢较多; ⑤不同激素组合中, 以BA05 +KT1. 0 +IBA0 001组合效果最好。核桃试管芽苗继代培养的最佳培养条件为: 芽苗在新改良DKW+BA05 +KT1. 0 +IBA0 001 +琼脂7g/L+蔗糖30g/L培养基上变温培养20d。     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

多菌灵降解菌株的分离以及降解条件研究

[目的]研究菌株降解多菌灵的条件。[方法]用富集培养法,分离出1株降解多菌灵的细菌,对其降解效能及特性进行研究。[结果]该菌株为假单胞菌属,5 d内对100 mg/L多菌灵的降解率为61%,能够以多菌灵为碳源进行生长。25~35℃内菌株对多菌灵的降解较好。菌株对多菌灵的降解在pH值5.0~8.0内相差不大。随着接种量的增大降解率增加,接种量为10%时最大。随着碳源、氮源的加入降解率增加,碳源加葡萄糖降解率最大为86%,氮源加0.5%蛋白胨降解率最大,5 d后对多菌灵的降解率达90%。多菌灵浓度较低时,菌体的生长量随培养时间的延长而增加;多菌灵浓度较高时,菌体的生长表现出先缓慢增加后减小的趋势。[结论]pH值7.0、培养温度30℃、接种量10%、0.5%蛋白胨碳源为该菌株降解多菌灵的最佳条件。     

碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法测定甲醇处理的瘤胃液中氨态氮浓度

[目的]建立一种适于测定用甲醇处理的瘤胃液中氨态氮浓度的碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法方法.[方法]比较加或不加甲醇对标准氨态氮线性回归方程的影响,对比色波长、显色稳定性进行测定,进行回收率、精密度试验,并用建立的方法实际测定甲醇处理的绵羊癌胃液中氨态氮浓度.[结果]反应物在37℃水浴10 min、室温下放置10 min后显色更加稳定,最大吸收波长为650nm;氨态氮浓度在1～32 mg/100 mL时与650nm处吸光度值的相关系数为0.9999,回收率97.2;～103.7;(平均为99.9;);标准溶液和样品溶液的吸光度值日间变异系数、日内变异系数均小于5;.[结论]在样品液中含有50;体积比例的甲醇对碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法测定氨态氮浓度没有影响,可用于经甲醇处理的瘤胃液中氨态氮浓度的测定.     

Hemagglutinating Activity of Duck Tembusu Virus

【Objective】 The objective of this paper was to study the hemagglutinating activity of duck Tembusu virus (DTMUV). 【Method】The DTMUV was inoculated intracerebrally in the 1-3-day-old sucking mice of BALB/c in different dilution to observe the morbidity. The brains of sucking mice were collected and purified according to the referenced methods. The purified virus fluid was inactivated by suitable inactivator, followed by the inactivated inspection in 6-day-old SPF chicken embryo. The virus fluid was evaluated the hemagglutinating activity with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The concentration of the erythrocyte suspension used in the hemagglutination test was compared to select the proper concentration. The pH value of the reaction system between 6.0-7.0 and the reaction temperature including 4℃, room temperature and 37℃ were compared. 【Result】 In the 6 day after inoculation , the sucking mice inoculated with 1:10 dilution appeared severe clinical symptoms including twitch, paralysis, and most of them were in agonal stage, while the symptoms of the sucking mice inoculated with 1:50 and 1:100 dilution were slighter. The purified DTMUV fluid was pinkey and clarified. It could be inactivated by formaldehyde but not β-propiolactone that would produce lots of flocks and change the property of the fluid. The DTMUV could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine, and the agglutination graphics was clear and stable when the concentration of the erythrocyte suspension was 0.33%. The hemagglutinating activity of DTMUV could be showed when the reaction system pH value was 6.0-6.8, while the highest hemagglutination titer appeared during the pH 6.0-6.2. Furthermore, the hemagglutinating activity could be appeared at 4℃, room temperature and 37℃, respectively, although the time required for hemagglutination at 4℃ was much longer. 【Conclusion】The DTMUV proliferated in the sucking mice of BALB/c had a broad spectrum of hemagglutinating activity that could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The hemagglutinating activity was stable and could hemagglutinate with the goose erythrocyte at 4℃, room temperature and 37℃. The suitable reaction conditions were 0.33% concentration of the erythrocyte suspension and pH 6.0-6.2 of the reaction system.     

菊苣酸的胃肠道稳定性研究

[目的]研究天然药物紫锥菊中菊苣酸在胃肠道环境下的稳定性。[方法]选择不同pH溶液与大鼠胃肠道内容物溶液，采用HPLC．uV方法，检测菊苣酸在各种溶液中的含量变化。[结果]经过4h的孵育，大鼠大肠内容物和小肠内容物对菊苣酸无显著影响（P〉0．05），而菊苣酸在胃内容物中的降解率为36％。在不同的pH环境中，菊苣酸相对稳定。[结论]菊苣酸在不同pH条件及小肠、大肠内容物中相对稳定，而在胃中有一定程度的降解，推测酶类可能是引起其降解的主要原因。     

表达PRRSV 强弱毒Nsp2的Marc 145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响

为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。