无乳链球菌通过线粒体途径诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的研究

为了探讨无乳链球菌对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响及其相关机制,试验以奶牛乳腺组织为材料分离培养奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)并进行鉴定,然后用无乳链球菌感染BMECs(试验组),并以未感染的BMECs作为对照组,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测无乳链球菌对BMECs凋亡的影响,以JC-1染色法检测BMECs线粒体膜电位的变化,并通过Western-blot分析测定BMECs凋亡途径中Bax、Bcl-2、细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表达水平。结果表明：所分离的BMECs呈多角形或椭圆形,角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)在细胞内呈阳性表达,符合BMECs的特征。与对照组相比,试验组的细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),线粒体膜电位降低,BMECs中Bcl-2蛋白相对表达量极显著下降(P<0.01),同时Bax、Caspase-3和Cyt C蛋白相对表达量极显著增加(P<0.01)。说明无乳链球菌可诱导BM...     

无乳链球菌体外感染奶牛乳腺上皮细胞

用分离到的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)及标准菌株侵袭原代奶牛乳腺上皮细胞建立体外感染细胞模型,并进行细胞凋亡检测。同时,采用qRT-PCR方法检测细胞受到侵袭后白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等细胞炎性因子mRNA的转录水平。结果显示,标准菌株组(WL组)与空白组相比凋亡率差异极显著(P<0.01),分离菌株组(FL组)与空白组相比凋亡率差异极显著(P<0.01),分离菌株组与其标准菌株组的凋亡率差异也极显著(P<0.01)。qRT-PCR结果分析显示,标准株组TNF-α、IL-6及IL-8 mRNA转录水平与对照组相比,差异极显著(P<0.01);而分离菌株组TNF-αmRNA转录水平与对照组相比差异显著(P<0.05),IL-6及IL-8 mRNA转录水平差异不显著(P>0.05)。结果表明,与标准菌株相比,无乳链球菌分离株对奶牛乳腺上皮细胞侵袭和损伤能力较低,乳腺细胞的凋亡率也较低,当奶牛乳腺上皮细胞受到细菌侵袭的时候,细胞中IL-6、IL-8及TNF-α等炎性因子mRNA的转录水平都显著性提高,但在相同浓度下GBS标准株诱导细胞炎性因子的表达量显著高于GBS分离株。本试验结果为以后预防和控制GBS引起的隐性乳房炎提供试验依据。     

牛磺酸对乳房链球菌侵染乳腺上皮细胞所致炎性变化的缓解作用

为探讨乳房链球菌(Streptococcus uberis)感染乳腺上皮细胞后产生的炎症变化及牛磺酸对炎性变化的缓解作用,以小鼠乳腺上皮细胞系Ep H4-Ev和乳房链球菌0140J为研究对象,检测二者共孵育后细胞产生的炎性变化;在此基础上探究牛磺酸对乳房链球菌对Ep H4-Ev黏附及其造成的炎性损伤的影响。结果表明:牛磺酸处理对乳房链球菌的黏附有一定的抑制作用,但不同浓度牛磺酸处理差异不显著(P0.05)。乳房链球菌感染Ep H4-Ev 2 h后,细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)mRNA表达水平及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活性显著提高(P0.01);4 h后乳铁蛋白(LF)mRNA表达水平显著上升(P0.01)。牛磺酸处理小鼠乳腺上皮细胞3 h,可显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平和NAGase活性(P0.01)。研究表明:牛磺酸可以减弱因乳房链球菌感染而引起的小鼠乳腺上皮细胞的炎性变化,该作用可能与其降低乳房链球菌对Ep H4-Ev的黏附有关。     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离与鉴定

利用THB固体培养基和色素培养基初步筛选出奶牛乳房炎中无乳链球菌,以分离的12株疑似菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,对扩增产物进行分析,结合选择培养的生理生化特性对分离菌进行鉴定。结果表明,12株疑似菌中有8株为无乳链球菌.     

乳酸链球菌素治疗奶牛乳房炎效果观察

奶牛乳房炎是奶牛产后常见疾病,其症状表现为乳房实质、间质的炎症,诸如病原体感染、乳腺感染、机械性刺激等均有可能成为发病诱因,对于奶牛产奶量与养殖效益具有重要影响。选取乳酸链球菌素用于奶牛乳房炎的临床治疗,对于临床型乳房炎与隐性乳房炎均可收获较好的治疗效果,恢复奶牛泌乳性能。     

我国奶牛乳房炎无乳链球菌抗生素耐药性研究

为了查明我国奶牛乳房炎无乳链球菌对抗生素耐药情况,指导临床合理用药,从我国部分地区奶牛场采集的临床型奶牛乳房炎病乳中分离鉴定出无乳链球菌115株,采用K-B纸片法测定了这些菌株对抗生素的耐药情况。结果表明,无乳链球菌对目前临床上使用的大部分抗生素,如头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、强力霉素、麦迪霉素、林可霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、环丙沙星、氟哌酸、氨苄青霉素/舒巴坦、头孢噻肟/棒酸和头孢他啶/棒酸均比较敏感;但对青霉素G、氨苄青霉素、链霉素、恩诺沙星、阿莫西林/棒酸和复方新诺明等有一定耐药性,其耐药率达50%～100%。     

通辽地区奶牛乳房炎无乳链球菌的分离与鉴定

为研究通辽地区奶牛乳房炎优势性病原菌,试验对30份奶牛临床型乳房炎奶样进行细菌分离,经血液琼脂平板分离培养、生化试验及药敏试验共分离到14个菌株,最终鉴定为无乳链球菌。药敏试验结果表明,分离菌株对临床上常用的链霉素及磺胺类药物均已产生不同程度的耐药性,而对卡那霉素、庆大霉素及麦迪霉素表现出较好的敏感性。     

Nisin抗菌肽治疗奶牛无乳链球菌性隐性乳房炎后主要乳成份的变化

将36头无乳链球菌引起的隐性乳房炎奶牛分成试验组和对照组,每组18个病例.试验组奶牛用Nisin抗菌肽经患病乳房内灌注,每天1次,连续治疗3 d,对照组奶牛不治疗.分别采集治疗前和治疗后1、3、5周的奶样进行细菌学检查,体细胞含量测定和乳成份分析.结果表明,经Nisin治疗后,细菌阳性乳区数和体细胞教(SCC)大于500 000/mL乳区数量均显著降低,牛奶中脂肪、蛋白质、乳糖和总固体含量有升高趋势,尤其是蛋白质和乳糖的含量显著高于治疗前.由此可见,Nisin乳房内注入对于奶牛无乳链球菌性隐性乳房炎具有良好的治疗作用.     

无乳链球菌性乳房炎的诊治与探讨

乳房炎是兽医床上的常见疾病，一直困扰着兽医临床诊治工作。引起乳房炎的病因是多方面的，无乳链球菌只是引起乳房炎发生的其中1种病原菌。     

奶牛无乳链球菌性乳房炎的诊治

乳房炎是兽医临床上的常见疾病,一直困扰着兽医临床诊治工作。引起乳房炎的病因是多方面的,无乳链球菌只是引起乳房炎发生的其中1种病原菌。1病因无乳链球菌是牛群中乳腺炎的高度传染性病原菌,对规模饲养的奶牛,其危害是相当严重的。不规范的榨乳程序会     

乳房链球菌对克林霉素耐药基因的定位

采用试管稀释法和纸片法测定9株乳房链球菌对克林霉素的耐药性，通过PCR反应检测克林霉素的耐药性基因，并进行测序比较。发现克林霉素对乳房链球菌的抗菌活力较强，克林霉素耐药基因同时存在于乳房链球菌的染色体和质粒上。     

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒，并导入到山羊乳腺上皮细胞，经G418及PCR筛选获得阳性细胞；转染细胞增殖后经激素诱导，培养液上清通过Western blot检测证明，转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白，其分子质量为58ku。     

牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的检测及核型分析

本试验用Western-blotting检测奶牛乳腺上皮细胞培养液中的β 酪蛋白，鉴定该细胞的生理功能是否正常；通过分析染色体数目及核型以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示：培养液中含有β 酪蛋白，说明该乳腺上皮细胞生理状况良好；染色体数目正常，染色体数目为60，核型与哺乳动物染色体图谱一致，说明该细胞系在体外培养条件下未发生转化。     

含蛋氨酸二肽影响奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关基因表达

本试验旨在研究含蛋氨酸(Met)二肽对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳蛋白合成相关基因表达的影响。试验分3部分,均采用单因子完全随机试验设计,Met的添加浓度及培养时间分别为60μg/m L(0.402 mmol/L)、48 h。第1部分,培养液添加8种含Met二肽[蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)、蛋氨酸-赖氨酸(P-Met-Lys)、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-苏氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-异亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-缬氨酸(P-Met-Val)],以不添加二肽为对照,测定BMECs乳蛋白合成相关基因(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、Ⅱ型小肽转运载体和氨肽酶氮)的表达量;第2部分,培养液添加8种与上述二肽对应的游离氨基酸(F-Met-Met、F-Met-Lys、F-MetTrp、F-M et-Phe、F-M et-Thr、F-M et-Ile、F-M et-Leu、F-M et-Val),以不添加游离氨基酸为对照,测定BM ECs乳蛋白合成相关基因的表达量;第3部分,用二肽等物质的量替代相应游离氨基酸,测定BMECs乳蛋白合成相关基因的表达量以及细胞内外氨肽酶含量。结果表明:P-Met-Met和P-M et-Lys组较对照组和其他二肽组上调了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白基因的表达量,且P-M et-M et组优于P-Met-Lys组。F-Met-Met和F-Met-Lys组较对照组和其他游离氨基酸组显著提高了αs1-酪蛋白基因的表达量(P0.05)。除P-Met-Val和P-Met-Leu组外,其他二肽替代游离氨基酸后均不同程度地提高了乳蛋白和Ⅱ型小肽转运载体基因的表达量,其中P-Met-Met表现出较好的促进效果。总之,含Met二肽等量替代对应的游离氨基酸能够促进乳蛋白基因的表达,其中尤以P-Met-Met的效果最好。     

赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究赖氨酸(Lys)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响,探讨Lys影响乳脂肪合成的机理。将第3代BMECs随机分为6组,每组6个重复,每个重复1个培养孔。各组培养基中Lys的浓度分别为0.5(基础培养基,对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/L,37℃、5%CO2培养48h后测定BMECs甘油三酯(TAG)含量、乳脂肪合成相关基因和蛋白的表达量。结果表明:BMECs内TAG含量(P=0.013)以及脂肪酸结合蛋白3(FABP3,P=0.001)、脂蛋白脂酶(LPL,P=0.096)、脂肪酸合成酶(FASN,P=0.003)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6,P=0.038)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM,P=0.022)基因表达量对Lys呈显著或趋于显著的浓度依赖效应。FABP3基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组和LPL基因表达量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);FASN基因表达量以2.0mmol/L组最高,显著高于16.0mmol/L组(P0.05);硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因表达量以2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05);磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1 A1)和黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因表达量均以1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因及蛋白表达量均以2.0、4.0mmol/L组显著高于0.5和8.0、16.0mmol/L组(P0.05);固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)基因表达量以1.0、2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05),蛋白表达量以1.0 mmol/L组显著高于其他组(P0.05)。但高浓度Lys抑制AGPAT6和GPAM的基因表达,AGPAT6基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0mmol/L组(P0.05),GPAM基因表达量以16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L组(P0.05)。可见,Lys对BMECs的乳脂肪合成具有显著的促进效果,但高浓度的Lys抑制了乳脂肪合成相关基因的表达。本试验条件下,培养基中Lys适宜浓度为2.0~4.0mmol/L。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM＋10%胎牛血清＋5%DMSO;B组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%DMSO;C组：75%DMEM＋10%胎牛血清＋15%DMSO;D组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%DMSO;E组：85%DMEM＋5%胎牛血清＋10%DMSO;F组：75%DMEM＋15%胎牛血清＋10%DMSO;G组：70%DMEM＋20%胎牛血清＋10%DMSO;H组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%甘油;I组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%甘油;J组：60%DMEM＋10%胎牛血清＋30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性（P〉0.05）;传代后B组细胞的生长状况最好。     

不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过不同的方法分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果.结果表明:组织块接种、0.25%的胰酶和100 u/mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3 h.可以得到大量细胞用于原代培养.在以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、100μg/mL的双抗、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠等,组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好.上皮细胞显微结构显示:奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中舍有不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈多角形,细胞之间连接成片,细胞界限明显,部分细胞界限不明显.     

甘氨酰tRNA合成酶对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-tRNA synthetase,GlyRS)是重要的氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)家族成员。目前,国内外关于GlyRS 在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。为了揭示GlyRS的表达与奶牛乳腺发育与泌乳之间的关系,本试验应用EdU免疫荧光法、流式细胞术检测GlyRS对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)中DNA数目及细胞周期的影响,实时荧光定量PCR、Western blotting技术检测GlyRS对BMEC中Cyclin D1的表达影响。结果显示,GlyRS过表达时,细胞的DNA合成、处于S期和G2/M期的细胞数、细胞中Cyclin D1的表达均增加;GlyRS抑制后,细胞的DNA合成、处于S期和G2/M期的细胞数、细胞中Cyclin D1的表达均减少。表明GlyRS通过上调Cyclin D1的表达,加快细胞周期转换,增加DNA合成数目,从而促进BMEC增殖。     

Effect of Glycyl-tRNA Synthetase on Cell Proliferation of Bovine Mammary Epithelial Cells

Glycyl-tRNA synthetase is an important member of aminoacyl-tRNA synthetase family.However,the knowledge about expression and regulation mechanism of GlyRS in the development of bovine mammary gland is limited.To reveal the relationship among GlyRS and bovine mammary gland development and lactation,EdU immunofluorescence and flow cytometry were used to analyze the impact of GlyRS on the number of DNA and the influence of the cell cycle of BMEC,and the expression of Cyclin D1 of BMEC by Real-time PCR and Western blotting.The results showed that the DNA synthesis of BMEC,the numbers of cells in S and G2/M phase,and Cyclin D1 expression levels in BMEC were all increased after BMEC was transfected with a GlyRS overexpression vector,whereas all of the above indexes were reduced after BMEC was transfected with a shRNA targeting against GlyRS.This study revealed that GlyRS accelerates cell cycle transformation,increases the number of DNA synthesis by upregulating the expression of Cyclin D1,thereby promoting BMEC proliferation.     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。