鲜牛乳生产中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性与散播

探求生鲜牛乳生产中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药情况和散播特点,采集山西某奶牛养殖区的内外环境、挤奶间环境及乳等各生产环节样本,经细菌分离、纯化培养、16S rRNA鉴定、苯唑西林和头孢西丁药敏纸片法及mecA基因扩增筛选MRSA,测定了其对14种抗生素的药物敏感性,利用mecA基因序列和ERIC-PCR指纹图谱分析鲜牛乳生产中MRSA的遗传相似性。结果显示,从721份生鲜牛乳生产样本中分离鉴定出184株金黄色葡萄球菌,其中90株为MRSA,检出率为48.9%;药敏试验显示,MRSA表现不同程度的耐药性和多重耐药性,对青霉素G的耐药率为95.6%,多重耐药种数主要集中在6～8耐;mecA基因序列分析显示,MRSA的mecA耐药基因同源性为95.22%,不同序列有程度不一的碱基位点缺失和突变;ERIC-PCR同源性分析显示,90株MRSA的DNA指纹图谱相似性为52%～100%,其中牛乳中MRSA与牛场(15株)、挤奶间(3株)、居民区空气(1株)的同源性在90%以上。提示在生鲜乳生产环节中均存在大量MRSA的污染,且呈多重耐药性,并可在牛场、挤奶间和附近环境通过直接接触和形成微生物气溶胶污染生鲜牛乳。     

新疆北部部分地区副猪嗜血杆菌的ERIC-PCR指纹聚类分析

为了解新疆北部部分规模化养猪场副猪嗜血杆菌(H.parasuis)分离株的基因型,本实验采用ERIC-PCR方法结合统计学分析软件,对来源不同的12株H.parasuis进行分子指纹图谱分析.结果表明12株分离株分别位于4个聚类中,各个菌株之间的遗传距离较近,并且含有长度为1 000 bp的相同条带,相同血清型的分离株在其分子指纹聚类上均位于同一个分支中.试验结果表明基于ERIC-PCR的分子指纹聚类分析结合传统的琼脂免疫扩散法可以准确地对不同分离株H.parasuis进行分型.试验结果显示H.parasuis在该地区广泛存在并具有多种不同的基因型,同时为该地区H.parasuis的免疫防治提供了重要的实验依据.     

中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR方法,在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对分离自中国东南部发生Glasser's病的不同猪场的111株副猪嗜血杆茵进行了指纹鉴定.结果显示:111株分离株显示出23种指纹图谱,前3种最流行的指纹图谱为ERIC-PCR X X(20/111),X X ⅢⅠ(9/111)和Ⅳ(8/111).且在111株分离株中,来自不同地区的分离株分别表现出不同种类的指纹图谱.该试验表明,ERIC-PCR方法可适用于对某一地区的副猪嗜血杆菌进行分子流行病学的研究和基因型的鉴定;试验结果还揭示了副猪嗜血杆茵在中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型.     

鸡舍内外环境中气载大肠杆菌同源性的分子鉴定

采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在5个鸡场舍内空气、舍外上风向和下风向不同距离收集气载大肠杆菌;并收集鸡的粪便,分离大肠杆菌。利用大肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链式反应（ERIC-PCR）分型技术,扩增不同测量点收集的大肠杆菌的DNA图谱。通过每个采样点的大肠杆菌的浓度变化以及大肠杆菌遗传相似性分析确认动物舍微生物气溶胶向舍外环境的传播。结果显示：5个鸡舍内空气中大肠杆菌的浓度远远高于舍外上风和下风向的大肠杆菌浓度（P〈0.05或P〈0.01）,但是舍外不同距离间的大肠杆菌浓度差异并不显著（P〉0.05）。同样,ERIC-PCR结果表明,从鸡的粪便中分离的大肠杆菌与从舍内空气中分离的部分大肠杆菌（34.1%）,以及从鸡场舍外下风方向分离到的多数大肠杆菌（54.5%）与从舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性可达100%。而从鸡舍上风向分离到的大肠杆菌与从舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性为73%-92%。从而说明来自动物体的大肠杆菌既能污染舍内空气,又能对其周围的环境构成污染。本研究揭示了微生物气溶胶的传播规律,具有公共卫生及流行病学意义。     

副猪嗜血杆菌野外分离株的ERIC-PCR 及其外膜蛋白图谱分析

为了解副猪嗜血杆菌(HPS)现地分离株的流行情况及其进化来源,本研究采用肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)分型和外膜蛋白(OMP)分型技术对采集自3个猪场的24株HPS分离株进行分型.结果表明,以ERIC-PCR法分析24个分离株共产生10种DNA指纹图谱,依次分别包含5株、3株、1株、7株、1株、2株、1株、1株、2株和1株分离株.其中一个猪场的分离株仅为图谱Ⅰ和Ⅱ,另外两个猪场分别为图谱Ⅲ、Ⅳ、V和Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X.试检测结果表明同一猪场存在的菌株有两种或两种以上基因型,并且不同猪场流行的基因型不同.采用OMP分型也表现出与ERIC-PCR分型一致的结果.因此,ERIC-PCR和OMP分型均可以用于HPS的流行病学调查.     

2009～2010年华南地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱的鉴定和分析

本试验采用肠杆菌基因间重复一致序列多态性聚合酶链式反应(ERIC-PCR)对2009~2010年分离自华南地区的41株副猪嗜血杆菌野生菌株及15株参考菌株进行了指纹图谱的鉴定。利用BioNumerics 5.1软件对所有菌株的ERIC-PCR指纹图谱进行分析,结果显示,15株具有不同血清型的参考菌株均具有不同的指纹图谱;41株华南地区副猪嗜血杆菌野生分离株则具有26个不同的指纹图谱,该方法对所有56株副猪嗜血杆菌的鉴别率为0.984。由此可见,ERIC-PCR分型方法具有较好种间的鉴别能力,可作为副猪嗜血杆菌病流行病学研究中的一种有效的辅助分子手段。     

2012～2014年江西地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对2012~2014年分离自江西地区41株副猪嗜血杆菌临床分离菌株进行指纹鉴定。结果表明,41株副猪嗜血杆菌产生20种不同的指纹图谱,相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,无法进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分。该方法证实副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱存在丰富的多样性,可适用于副猪嗜血杆菌的快速基因分型及分子流行病学调查。     

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌（E.coli）O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌（37 ℃、180 r/min）,接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37 ℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37 ℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37 ℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增（ERIC-PCR）指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。     

副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱多样性研究

建立了副猪嗜血杆菌ERIC-PCR分型技术,并应用于临床分离菌株的流行病学调查。试验结果表明,47株副猪嗜血杆菌产生28种不同的指纹图谱,分离自同一猪场和相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,不能进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分,证实副猪嗜血杆菌ERIC指纹图谱存在丰富的多样性,ERIC-PCR方法是副猪嗜血杆菌流行病学规律分析的有效方法。     

规模羊场环境气载产气荚膜梭菌耐药性及其ERIC-PCR分型

为监测不同规模羊场空气中分离的气载产气荚膜梭菌耐药性变迁及不同菌株间的遗传相似性,从而为临床治疗和控制感染提供依据,收集了2016—2017年来自不同规模羊场分离的气载产气荚膜梭菌30株,采用K-B法进行药敏试验,应用基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR),对菌株进行DNA分型及同源性分析。结果显示:30株气载产气荚膜梭菌在监测的9种药物中,对庆大霉素的耐药性最强(86.7%),其次为青霉素(43.3%),对头孢噻肟耐药率最低(1%),对其他药物耐药率在3.3%~36.7%之间;ERIC-PCR谱型表现为14个基因型(Ⅰ~XIV),其中大部分来源于不同的克隆株,且有2个克隆株的相似度为99.0%。本研究结果表明:规模羊场的气载产气荚膜梭菌多重耐药较严重,分子多样性复杂;气载产气荚膜梭菌来源广泛,不同地区、环境和条件下,同一种病原菌的基因型也存在一定差异,可能存在多个基因型;同一个规模羊场的基因型也不同,不同羊场之间也存在相同的基因型。     

副猪嗜血杆菌上海分离株的生物学特性与基因型分析

从培养特性、生化特性和耐药特性等多方面研究了副猪嗜血杆菌(HPS)上海分离株的生物学特性。各分离株因生存环境差异等原因表现出不同的生化和耐药特性,分离菌株对多种药物完全耐药,并且各菌株耐药性各不同。根据16SrRNA序列设计引物建立了目的条带为821bp的特异PCR快速检测方法,并对其产物进行测序鉴定与比对分析,结果表明所有分离株的PCR扩增产物序列比对结果与此前报道的HPS的同源性为97.3%～100%。运用ERIC-PCR扩增建立指纹图谱,通过聚类分析以确定其基因型特征,ERIC-PCR将20株菌分为Ⅰ和Ⅱ2个大类群,分离株均属于Ⅰ群A亚群。快速PCR检测方法的建立和基因型研究为上海地区HPS的监控提供了理论基础,并揭示各分离菌株具有一致的遗传进化背景与方向。     

大熊猫粪便菌群ERIC-PCR指纹图谱的分析及优势菌群的鉴定

探讨1只野生大熊猫和不同年龄段圈养大熊猫粪便菌群的多样性和相似性,并鉴定野生大熊猫圈养之后,其粪便中的优势菌群.对来自3个年龄段9只(3只亚成体、3只成年体、3只老年体)圈养大熊猫及1只野生大熊猫圈养前、后的11份粪便细菌的DNA进行ERIC-PCR指纹图谱分析,并利用16S rRNA基因序列分析对优势菌条带进行鉴定.结果显示:该只野生大熊猫粪便菌群多样性比圈养大熊猫丰富;圈养大熊猫粪便菌群多样性:成年体＞亚成体＞老年体;16s rRNA和ERIC-PCR指纹图谱优势条带鉴定的优势菌结果有差异性.结果表明:大熊猫的肠道菌群多样性易受生长环境、年龄因素的影响;其次, 不同年龄段的圈养大熊猫,其肠道菌群的相似性与年龄因素不相关;利用ERIC-PCR指纹图谱优势条带鉴定优势菌的方法有一定的局限性.     

广西地区副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱分型研究

为探讨肠道细菌基因间重复序列(ERIC)的聚合酶链反应(PCR)技术用于副猪嗜血杆菌基因分型的可行性,对分离自广西地区不同猪场的22株副猪嗜血杆菌进行ERIC-PCR指纹图谱分型研究.结果发现,22株分离株显示出12种指纹图谱,可以区分无法进行血清分型的菌株.表明ERIC-PCR可适用于对副猪嗜血杆菌进行分子流行病学调...     

奶牛养殖场环境大肠杆菌的ERIC-PCR分型和系统进化分群

旨在了解奶牛养殖场环境中大肠杆菌流行情况及遗传多样性,探究不同样品分离菌株的遗传关系及系统进化分群情况,收集2017-2019年新疆某大型奶牛场养殖环境中的209份样品进行大肠杆菌分离和16S rRNA鉴定,对非重复菌株进行ERIC-PCR分型和系统进化分群试验.结果显示,共分离到338株大肠杆菌,分离率为67.46％...     

鸭源沙门菌的分离鉴定及分型研究

为了解徐州地区鸭源沙门菌的感染情况,对徐州市场和超市300份样品(鸭肉及副产品)、6个养鸭场的380份样品(鸭泄殖腔肛拭子、粪便以及饲料和用具等)以及50例临床发病鸭的脏器组织样品(肝、脾、盲肠等)进行增菌培养,通过细菌分离培养特性、生化反应和血清型鉴定,成功分离到56株鸭源沙门菌。市场及超市产品共分离到6株沙门菌,分离率为2%,优势血清型为肠炎沙门菌;鸭场共分离到26株沙门菌,分离率为6.8%,优势血清型为肠炎沙门菌;临床发病鸭分离到24株,分离率为48%,其优势血清型为印第安纳沙门菌和肠炎沙门菌。对21株沙门菌进行ERIC-PCR分子分型,分成18类基因型,遗传相似性在59%~100%,结果显示出良好的多态性,获得了较好的指纹图谱数据。     

生鲜乳收购站化验室建设的研究与分析

生鲜乳收购站作为第一责任人,严格控制生鲜乳的质量安全也成为当前生鲜乳收购站生产过程中严把质量关的重中之重。生鲜乳收购站化验室的建设是保证生鲜乳质量安全的一个重要环节,直接影响着生鲜乳质量安全的水平,因此如何加强规范生鲜乳收购站化验室的建设是一个重要的问题,本文就从这一问题入手来进行阐述,为生鲜乳收购站的化验室建设提供技术参考。     

兔粪中微生物区系ERIC-PCR DNA指纹图谱的建立及分析

本研究旨在将ERIC-PCR基因指纹图谱技术应用于兔粪微生物的分析中,建立一种快速分析检测兔肠道菌群变化的方法。通过对PCR反应条件的优化确定适合兔粪微生物的ERIC-PCR反应条件,对比兔粪微生物组和兔粪优势菌的ERIC-PCR DNA指纹图谱差异,从而分析兔粪微生物ERIC指纹图谱的特征。结果建立了适合兔粪样品ERIC-PCR分析的反应体系,确定450bp处条带为双歧杆菌特征条带,1 300和4 000bp处为大肠杆菌特征条带;经发酵验证,图谱中的相应条带亮度变化趋势与计数平板所测结果相一致(相对亮度R与相对菌落数lg cfu的相关系数为0.967 6)。本研究优化建立了一种快速分析检测兔粪中菌群变化的ERIC-PCR指纹图谱技术,该技术可较好反映兔粪中优势菌含量的变化情况,为兔肠道疾病的预防、诊断和治疗提供依据。     

6株副猪嗜血杆菌基因组DNA的PCR指纹图谱研究

根据肠道菌基因闻重复一致序列，设计了一对特异性引物，采用ERIC-PCR和RAPD技术，研究了副猪嗜血杆菌6个分离菌株的指纹图谱和DNA多态性。结果表明，6个分离株的PCR指纹图谱与15个标准血清型指纹图谱相比较可分辨出4种血清型；6个分离株的RAPD研究结果均表现出多态性。有意义的是，6个菌株的多态性DNA片段也能明显将其分为4种类型的副猪嗜血杆菌，与特异性引物PCR结果相一致。该研究可作为流行病学调查和该菌的分子分型快速诊断方法的基础。     

PCR指纹图谱技术在酸奶质量监测中的应用

用PCR指纹图谱技术对市售某品牌酸奶进行了短期动态监测,对于收集的3个生产批次的9个酸奶样品,用ERIC（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,肠杆菌基因间保守重复序列）-PCR和PCR-DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,变性梯度凝胶电泳）指纹图谱技术对其菌种组成及其稳定性进行评价.ER-IC-PCR指纹图谱聚类分析结果显示,同一生产批次内3个不同包装的样品ERIC-PCR指纹图谱相似性为90%左右,而不同生产批次样品之间ERIC-PCR指纹图谱相似性有所下降,为82%.该结果进一步用DGGE指纹图谱进行证实.DGGE分析结果表明,G2样品明显缺少一条主带,经割胶回收测序发现,这条主带代表的微生物是Lacto-bacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus,说明该产品不同生产批次间的稳定性不是很好.DGGE图谱和测序结果还显示,除G2样品外,该酸奶样品的菌种组成与产品标签说明是一致的.     

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌(E.coli)O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌(37℃、180 r/min),接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增(ERIC-PCR)指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。