水杨酸诱导表达AtCBF1的转基因烟草研究

CBF是植物低温驯化过程中的关键性调控因子,过量表达CBF可显著提高转基因植物的非生物胁迫抗性。但是,组成型高表达CBF基因常导致转基因植株生长受阻。通过使用人工合成的水杨酸诱导型启动子,结果发现拟南芥CBF1基因在转基因烟草中受低浓度水杨酸诱导表达,且不影响烟草的生长发育。本研究结果说明,组合化学诱导型启动子和CBF基因,可以用于提高作物的抗环境胁迫的遗传改良中。     

超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果(Malus domestica‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和PCR技术,分离细胞分裂素响应基因Md CRF6。使用MEGA 5.0软件构建苹果Md CRF6与拟南芥CRFs间系统进化树;通过SMART软件和DNAMAN软件分析Md CRF6蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应。通过电泳迁移率试验(EMSA),验证Md CRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建Md CRF6植物超表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md CRF6苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定Md CRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域,在C端包含保守的AP2/ERF结构域,并且与拟南芥At CRF6同源性最高。基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl处理3 h和6 h时表达量最高。EMSA试验结果验证Md CRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列。在苹果愈伤组织中超表达Md CRF6,发现Md CRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示,Md CRF6显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果Md CRF6与拟南芥At CRF6具有高度的同源性,其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达Md CRF6抑制其花青苷积累,降低植物抗盐性。推测苹果Md CRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调节花青苷积累和抗盐性。     

苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10的克隆及功能鉴定

【目的】克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10,研究其组织表达模式和低磷响应,并进一步研究MdPAP10在低磷条件下的功能,为深入研究MdPAP10在果树中参与紫色酸性磷酸酶分泌和影响磷吸收的分子机理奠定基础。【方法】本研究以‘嘎啦’苹果（Malus×domestica‘Royal Gala’）为试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10。通过NCBI分析MdPAP10的蛋白质结构并获得白梨、桃和草莓等10个物种的PAP10氨基酸序列,利用MEGA5.0构建系统进化树。利用qRT-PCR检测MdPAP10在苹果不同组织的表达情况和对低磷胁迫的响应特性。将MdPAP10连接到植物过表达载体pBI121,转化LBA4404农杆菌,用于侵染苹果愈伤组织。通过在抗性培养基上筛选和PCR鉴定,获得MdPAP10转基因愈伤组织。在低磷培养基上培养MdPAP10转基因愈伤组织检测其酸性磷酸酶积累情况以及对低磷胁迫的耐受性和磷含量。最后利用qRT-PCR检测MdPAP10转基因愈伤组织中磷相关基因的表达量。【结果】克隆获得苹果紫色酸性磷酸酶基因MdPAP10（基因序列号：MDP0000272096）,开放阅读框为1 332 bp,编码含有443个氨基酸的蛋白。蛋白质结构分析显示,MdPAP10包含一个信号肽和一个磷酸酶结构域。基因结构分析显示,MdPAP10含有5个外显子和4个内含子。进化树分析显示,苹果MdPAP10与白梨PbPAP10同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,MdPAP10在根、茎、叶、花、果中均有表达,并且在根中的表达量最高。MdPAP10对低磷条件有明显响应,在根中表达量逐渐升高,在6 h达到最大后逐渐下降;在叶中的表达量始终低于对照组。MdPAP10转基因愈伤组织在低磷条件下能够明显促进酸性磷酸酶的分泌。在低磷条件下培养转基因愈伤组织20 d发现过表达MdPAP10提高了愈伤组织对低磷胁迫的耐受性,并且提高了对磷的吸收。qRT-PCR结果显示,过表达MdPAP10能够明显促进苹果磷相关基因的表达。【结论】MdPAP10能够对低磷胁迫有明显响应,在低磷条件下能够促进磷吸收和酸性磷酸酶的分泌。MdPAP10在响应低磷胁迫过程中发挥着重要的正调控作用。     

苹果乙烯响应因子MdERF72对非生物胁迫的响应

【目的】乙烯响应因子（ethylene response factor,ERF）是植物特有的一类转录因子,参与植物根系形成、下胚轴伸长、果实成熟、器官衰老等生长发育过程,在调节植物生物和非生物胁迫反应及果实品质过程中发挥着至关重要的作用。克隆苹果乙烯响应因子MdERF72,通过表达分析和转基因功能分析,研究其在抵御非生物胁迫过程中的功能,为探索MdERF72在植物生长发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以‘王林’苹果（Malus×domestica Borkh.）愈伤组织为试材,利用RT-PCR技术克隆MdERF72,利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等,并利用MEGA5.0构建系统进化树,与拟南芥ERF-B2亚家族进行蛋白序列同源性分析;利用实时荧光定量PCR技术探明其在苹果组织中的表达和果实发育时期的时空表达特征;同时利用实时荧光定量PCR技术检测‘嘎拉’苹果组培苗中MdERF72对ACC、NaCl以及低温的响应;构建基因的过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得稳定遗传的过表达苹果愈伤组织;检测NaCl以及低温处理后,野生型和转基因苹果愈伤组织的鲜重、丙二醛含量、电导率、过氧化氢含量以及超氧阴离子含量的差异。【结果】MdERF72位于苹果第13号染色体上,该基因存在1个ERF家族特有的AP2/ERF结构域。进化树分析结果显示,MdERF72与拟南芥AtERF72序列同源性较高,都属于ERFs家族的B2亚家族。氨基酸理化性质分析表明,MdERF72编码253个氨基酸,预测其蛋白质分子量为27.61 kD,等电点（pI）为5.10。另外,亲疏水预测结果显示MdERF72疏水部分大于亲水部分,表明其属于疏水性蛋白。磷酸化位点分析显示,MdERF72只有苏氨酸磷酸化位点,表明该蛋白可能受到磷酸化作用的调控。MdERF72启动子序列中含有与茉莉酸（JA）、生长素及干旱信号相关的顺式作用元件。MdERF72是乙烯正调控转录因子,在苹果的各组织中均有表达,在果实和茎中表达量相对较高;并且在果实中随着果实的成熟,表达量逐渐升高。苹果组培苗中MdERF72的表达明显受到高盐和低温的诱导。过量表达MdERF72的苹果愈伤组织在高盐和低温胁迫处理下,生长势明显比野生型对照强,电导率,丙二醛、过氧化氢、超氧阴离子的含量都低于野生型,表明MdERF72提高了对盐和低温胁迫的抗性。【结论】MdERF72在响应高盐、低温胁迫过程中发挥着重要的正调控作用,过表达MdERF72可以提高苹果愈伤组织对高盐和低温胁迫的抗性。     

苹果生长素响应因子MdARF5的克隆与功能鉴定

【目的】分离苹果生长素响应因子MdARF5（Auxin Response Factor 5）,分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示MdARF5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果（Malus×domestica ‘Royal Gala’）为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个ARF（Auxin Response Factor）转录因子,并将其命名为MdARF5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析MdARF5对MdMYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子MdARF5（序列号：MDP0000143749）,该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果MdARF5与梨PbARF5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达MdARF5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明MdARF5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个MdARF5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,MdARF5能够抑制MdMYB1的表达。【结论】推测苹果MdARF5可能通过直接抑制MdMYB1的表达负调节花青苷的积累。     

根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株

 为改良草坪型高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的耐逆性，以成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法将拟南芥（Arabidopsis thaliana）耐逆相关CBF1基因导入4个供试品种的基因组，经GUS染色、PCR检测和Southern杂交分析验证，获得了112株转基因植株，转化频率为0.92% ~2.87%，不同品种间存在差异。试验表明，在高盐与高渗胁迫下，转基因植株具有显著生长优势，存活率极显著高于非转化对照植株，经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率平均较对照植株低25% ~ 30%，证明转基因植株的耐逆性有所增强。考察发现，非胁迫条件下CBF1基因的组成型超表达使转基因植株的生长受到抑制。     

荠菜CBF冷诱导途径多价载体的构建和烟草转化

为了研究荠菜CBF抗冷途径多基因共表达对转基因植株耐寒性的影响,通过同尾酶法将CbCBF、CbICE53、CbRCI35以及CbCOR15bP进行结合,构建了CbCOR15bP::CbICE53+pCaMV35S::CbCBF+pCaMV35S::CbRCI35多价植物表达载体并进行了烟草的转化,通过形态观察以及电解质渗透率和相对水含量这两个生理指标的测定显示,转基因植株在4℃和-4℃低温处理情况下,多基因共转化的转基因植株在电解质渗透率和相对水含量与野生型和空载对照之间的差异非常明显,转基因植株在低温下的抗寒冻能力也明显增强,说明CBF途径多基因共转化可以明显提高烟草的抗寒冻能力,此项研究具有一定的实际应用意义。     

转CBF3基因烟草的抗寒性研究

为了解拟南芥转录因子CBF3基因转化烟草的抗寒性,利用农杆菌介导法将由诱导型启动子RD29A调控的CBF3基因导入烟草,获得Southern阳性转基因烟草;将转基因烟草幼苗及对照(未转基因烟草)在4℃低温胁迫8h,转基因烟草幼苗杭寒性强于对照;不同温度处理下转基因烟草及对照中渗透调节物质测定结果表明,低温处理下对照及转...     

APPLE SUMO E3 LIGASE MDSIZ1 NEGATIVELY REGULATES DROUGHT TOLERANCE

•MdSIZ1 RNAi transgenic apple trees are drought tolerance than wild type—GL-3.•MdSIZ1 RNAi plants get enhanced ability to keep water and scavenge ROS under drought conditions.•MdSIZ1 may participate in apple drought tolerance by affecting ABA biosynthesis.Drought stress typically causes heavy losses in apple production and uncovering the mechanisms by which apple tolerates drought stress is important in apple breeding. MdSIZ1 is a SUMO (small ubiquitin-like modifier) E3 ligase that promotes SUMO binding to substrate proteins. Here, we demonstrate that MdSIZ1 in apple has a negative relationship with drought tolerance. MdSIZ1 RNAi transgenic apple trees had a higher survival rate after drought stress. During drought stress they had higher leaf water potential, reduced ion leakage, lower H₂O₂ and malondialdehyde contents, and higher catalase activity. In addition, MdSIZ1 RNAi transgenic plants had a higher net photosynthetic rate during the latter period of drought stress. Finally, the transgenic apple trees also altered expression levels of some microRNAs in response to drought stress. Taken together, these results indicate that apple MdSIZ1 negatively regulates drought stress by enhancing leaf water-holding capacity and antioxidant enzyme activity.     

盐及ABA对水稻MYB转录因子基因表达的影响

转录因子在植物生长发育和响应外界环境胁迫过程中起重要作用。MYB类转录因子是植物中数量较多、功能多样化的一类转录因子。以耐盐聚合系177,以及该聚合系的轮回亲本IR64为材料,在苗期进行盐和盐+ABA处理,采用荧光定量PCR方法,比较分析了43个MYB家族基因在盐胁迫和盐+ABA处理下的表达谱。结果表明,在盐胁迫条件下,IR64和177中分别有42%和58%的MYB基因在叶片组织中下调表达,而外施ABA后,61%（IR64）和68%（177）的下调基因表达量显著增强。该结果说明盐处理条件下通过外施ABA能够引起MYB基因的表达变化,进而影响水稻的耐盐性。同时鉴定了12个在IR64和177间显著差异表达的MYB基因,该类基因的表达模式可能同两个品种具有不同的耐盐性紧密相关。该结果为进一步分析水稻MYB基因在响应盐胁迫过程中的作用机制以及ABA在增强水稻耐盐性方面提供了理论参考。     

平欧杂交榛CBF/DREB1转录因子ChaCBF1基因的克隆与功能分析

为研究榛属植物的抗寒分子机理,以平欧杂交榛‘达维’为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术克隆获得一个CBF/DREB1转录因子基因ChaCBF1,GenBank登录号为KT757373。该基因开放阅读框为666 bp,编码221个氨基酸,其相对分子质量为26.4 kDa,理论等电点为5.88。氨基酸序列比对结果显示ChaCBF1含有一个高度保守的AP2/ERF结构域,以及PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR等CBF蛋白特征序列。系统进化树分析发现ChaCBF1与垂枝桦BpCBF3蛋白的亲缘关系最近。通过基因枪轰击法使重组质粒p1302-ChaCBF1-GFP在洋葱表皮细胞瞬时表达,亚细胞定位结果显示ChaCBF1定位于洋葱表皮细胞的细胞核。通过实时荧光定量PCR检测了ChaCBF1基因在多种非生物胁迫下的表达模式,结果表明ChaCBF1基因的表达能够持续而强烈地响应低温信号,同时其表达也受干旱、高盐和ABA的诱导。通过农杆菌介导的花序侵染法将重组质粒p1301bar-ChaCBF1转化野生型拟南芥,对ChaCBF1基因的功能进行了研究。结果表明:过表达ChaCBF1的转基因拟南芥增强了对冷冻胁迫的耐受性,其成活率显著高于对照植株;转基因植株在正常和低温条件下能够显著上调冷响应基因RD29A和COR47的表达,并积累较高水平的游离脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质,从而提高其抗寒能力。研究结果表明,转录因子ChaCBF1基因在杂交榛冷响应途径中发挥重要作用。      

拟南芥AtCOR15a转化烟草及后代抗寒性研究

【目的】研究拟南芥AtCOR15a基因的抗寒功能。【方法】构建pCAMBIA1301-COR15a的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过抗生素筛选和PCR检测获得转基因烟草。低温胁迫后,利用蒽酮法和酸式茚三酮法测定转基因烟草后代与野生型烟草的可溶性糖和脯氨酸含量,同时观察其抗寒能力。【结果】转基因烟草后代可溶性糖含量和脯氨酸含量均比野生型烟草有所提高,并在第5 d达到峰值。低温处理后转基因烟草后代能正常生长,而野生型烟草则全部死亡。【结论】生理生化指标的测定发现,可溶性糖含量与脯氨酸含量的变化趋势与烟草的抗寒性呈正相关,AtCOR15a基因导入烟草中可以明显提高烟草对低温胁迫的抵抗力。     

植物MYB44转录因子的功能及其在橡胶树抗逆研究中的应用前景

MYB44是植物典型的R2R3-MYB转录因子,在不同物种间基因结构保守,可转录调控植物对干旱和盐等胁迫的抵抗能力。笔者总结了MYB44的结构特征,着重阐述MYB44转录因子在逆境响应中的调控机制与应用现状,并对Hb MYB44在橡胶树抗逆研究中的应用进行了展望。     

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据分析,获得一个MYB转录因子GmMYB111;以盐胁迫处理的cDNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因cDNA编码序列;根据GmMYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与GmMYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用 MEGA5.05对GmMYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析GmMYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据获得盐胁迫响应显著上调（27倍）的GmMYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB76、GmMYB12a以及苜蓿MtMYB61的亲缘关系最近; GmMYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,GmMYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,GmMYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,GmMYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示GmMYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,GmMYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】GmMYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。     

棉花MYB转录因子基因GbMYB5的克隆及表达分析

在对陆地棉Maxxa BAC文库所获得的一个BAC克隆进行测序分析过程中,发现一个新的MYB类转录因子,为探明其在棉花中的表达模式,采用RT-PCR技术从海岛棉品种H7124中克隆出该基因,命名为GbMYB5(GenBank登录号为:JF820389)。GbMYB5基因全长1 105 bp,编码277个氨基酸。RT-PCR结果表明GbMYB5基因在棉花的茎、叶、蕾、絮和未成熟的种子中均有表达,尤以叶片中的表达水平最高。重金属胁迫可短暂抑制GbMYB5基因表达,但表达量在处理48 h后回升到正常水平。PEG、脱落酸和赤霉酸诱导均可增强GbMYB5基因的表达。另外,构建了含有GbMYB5基因全长的植物过量表达载体,转化烟草。经PCR检测获得目的基因正常表达的转基因烟草9株,为研究该基因的抗逆作用奠定了基础。