意大利蜜蜂蜂王与工蜂幼虫甲基供体S-腺苷甲硫氨酸合成与代谢的差异

【目的】研究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)蜂王与工蜂幼虫甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)合成与代谢的差异,为探索DNA甲基化与蜜蜂级型分化的关系提供理论依据。【方法】试验选用890只1日龄雌性蜂幼虫,分别来自5群姐妹蜂王群。其中445只进行人工育王(89只/群);剩余445只培育成工蜂(89只/群)。取3、4、5日龄蜂王和工蜂幼虫,测定其体内SAM合成与代谢关键酶基因表达和酶活性的差异。【结果】蜂王幼虫SAM含量随日龄的增加变化不显著(P0.05);工蜂幼虫SAM含量随日龄增加呈上升趋势(P0.05)。蜂王幼虫SAMS基因表达量随日龄增加呈梯度下降的趋势(P0.01),而工蜂幼虫SAMS表达随日龄变化不显著(P0.05);3日龄与4日龄时,蜂王幼虫SAMS表达量显著高于工蜂(P0.05),5日龄时,工蜂幼虫SAMS表达量显著高于蜂王(P0.05)。Dnmt1a与Dnmt3表达在两级型间差异不显著(P0.05),其中蜂王幼虫Dnmt1a表达随日龄增加无显著变化(P0.05),但其酶活性呈下降趋势(P0.05);工蜂幼虫Dnmt1a表达随日龄增加呈下降趋势(P0.05),其酶活性呈上升趋势(P0.01),其中3日龄与4日龄时,蜂王幼虫Dnmt1酶活性显著高于工蜂幼虫(P0.05),而5日龄时,工蜂幼虫Dnmt1酶活性显著高于蜂王幼虫(P0.05)。蜂王Dnmt3表达量随日龄增加呈下降趋势(P0.05),工蜂幼虫Dnmt3表达随日龄增加变化不显著(P0.05);蜂王幼虫Dnmt3酶活性随日龄变化不显著(P0.05),工蜂幼虫Dnmt3酶活性随日龄变化显著(P0.05),但蜂王幼虫Dnmt3酶活性在3、4、5日龄均显著高于工蜂幼虫(P0.01)。【结论】3—5日龄意大利蜜蜂蜂王幼虫与工蜂幼虫体内活性甲基供体SAM的合成与代谢存在差异。在4日龄之前,蜂王幼虫SAM的合成比工蜂活跃,4日龄之后,工蜂幼虫的SAM合成与蜂王幼虫相近;在4日龄之前,SAM参与DNA维持甲基化的代谢过程,蜂王幼虫比工蜂活跃,4日龄之后,工蜂幼虫比蜂王幼虫活跃;在3—5日龄,SAM参与DNA从头甲基化的代谢活性,蜂王幼虫始终不低于工蜂幼虫。     

金鱼Dmrt2基因表达分析

采用荧光定量PCR技术检测了Dmrt2基因的两个亚型Dmrt2a和Dmrt2b在金鱼(Carassius auratus)不同发育时期以及不同组织中的表达情况,用RACE技术克隆得到金鱼Dmrt2a cDNA序列的全长为1 755 bp,5’和3’非编码区长分别为188 bp和67 bp,推测的开放阅读框可编码499个氨基酸的多肽。分子系统进化分析表明金鱼Dmrt2a与其它鱼类Dmrt2a基因聚成一支,与斑马鱼(Daniorerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、罗非鱼(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分别为85%、61%、58%、58%。荧光定量PCR结果揭示,Dmrt2a在精巢中表达量最高,在卵巢中次之,而Dmrt2b在卵巢中表达量最高,在精巢中次之,二者在肾脏、消化道、肝脏、心脏和脑中都有表达,但表达量低;不同发育时期胚胎和仔鱼的Dmrt2a和Dmrt2b表达量变化很大,Dmrt2a在受精后24 h达到最高值,之后表达量降低,而Dmrt2b在孵化后仔鱼中表达量显著增加。     

猪COPG2和MEST克隆、印记状况和组织表达分析

【目的】为了在猪中找到更多新的候选印记基因并分析它们在哺乳动物之间的保守性,以期为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息和分子标记。【方法】以长白与荣昌猪杂交F1 代一月龄个体为研究对象,通过比较生物学的方法,克隆COPG2和MEST全长cDNA,并分析基因的序列特点,然后利用 IMpRH(法国农业科学院的辐射杂种克隆板)分析COPG2和MEST在猪染色体上定位信息。通过RT-PCR产物直接测序方法分析了这些基因在一月龄F1代个体11个不同组织(心、胃、肌肉、肾脏、肺、肝、小肠、膀胱、舌头、脾和脂肪)的印记状况,并进一步利用Real-time PCR方法,分析其在一月龄F1代个体11个不同组织的表达情况。【结果】克隆得到2 817 bp COPG2和2 219 bp MEST序列。其中COPG2 包括2 616 bp 完整CDS(coding sequenc,编码序列)区域,分析表明其编码含871个氨基酸的蛋白质,MEST包括981 bp完整CDS区域,编码326个氨基酸的蛋白质。IMpRH分析结果表明,猪COPG2和MEST都位于猪18号染色体上并且与标记CL365941紧密连锁,LOD值分别为14.32和8.5。印记分析表明COPG2在11个组织中呈双等位表达,MEST在心脏、胃、肌肉、肾、肺、膀胱、舌头和脂肪中表达父方等位基因,但在肝脏、小肠和脾脏中呈双等位表达。荧光定量结果显示COPG2 和MEST总的表达量在一月龄个体各组织间存在着显著性差异(P＜0.01),其中COPG2和MEST在肾脏中表达量均高于其它各组织(P＜0.01)。【结论】在哺乳动物之间,COPG2序列较为保守但是印记状况却缺乏保守性;MEST序列和印记状况均较为保守,但MEST在猪中印记状况具有组织特异性。此外,染色体定位信息和印记状况证实了在猪的18号染色体上有由COPG2和MEST构成的新的印记域。     

山羊早期胎儿组织TET1与Wnt通路基因的表达变化及其相关性

【目的】通过检测TET1和Wnt信号通路相关基因以及DKK家族基因在山羊胎儿发育早期的表达变化,分析TET1与Wnt通路基因的相关性,为TET1调控山羊胎儿发育研究提供理论依据。【方法】选取12只健康大足黑山羊母羊,自然发情后与同一只种公羊自然交配。采用剖腹产手术的方法,分别获得妊娠20、25、30、60和90d的胎儿,对胎儿的生长指标(体重、体长)进行统计,并采集了60和90d胎儿的组织器官样品(心、肝、肺、肾、脑、皮肤),通过Real-time PCR(RT-PCR)检测各样品中TET1基因,DKK家族基因(DKK1、DKK2、DKK3)和Wnt家族基因(Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16)的相对表达量。利用SPSS软件分析山羊胎儿发育早期不同阶段TET1与WNT信号通路相关基因相关性以及基因表达显著性(P0.05)。【结果】山羊妊娠早期胎儿生长在60d后有显著变化。荧光定量检测结果表明,TET1基因表达随妊娠天数的增加呈上升趋势。Wnt家族基因在山羊胎儿发育中都检测到表达(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)。其中,Wnt2和Wnt7b表达量随胎儿发育逐渐增高;Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d时有显著高表达(P0.05);Wnt4在胎儿发育20 d时表达显著(P0.05);Wnt16基因在妊娠25 d有显著高表达(P0.05)。DKK家族基因表达检测结果显示,DKK1在胎儿发育早期阶段都有表达,DKK2/3在妊娠初期表达量较低,后期表达增高。通过组织中基因表达检测显示,TET1在90d胎儿肝、肺、肾和脑中的表达水平相比于60d胎儿组织升高,肝中表达量显著(P0.05)。Wnt家族基因Wnt2在组织器官中有相对活跃的表达,妊娠90d胎儿肺中表达量极显著(P0.01);Wnt16基因在胎儿皮肤组织中表达显著(P0.05),且维持在一个较高的水平;Wnt5a和Wnt7b在肾中表达显著(P0.05),其他Wnt基因在组织中都有表达。相关性分析显示,胎儿生长指标(体重、体长)变化与TET1的表达呈极显著正相关(P0.01);TET1在胎儿发育早期的表达与Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈现正相关,与Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈负相关,其中与Wnt5b呈显著负相关(P0.05),与Wnt7b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt通路基因之间也有相互关系,Wnt2与Wnt4呈极显著负相关(P0.01)。Wnt2与Wnt7b,Wnt2b与Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a与Wnt5b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt4与Wnt5a呈显著正相关(P0.05)。【结论】获得了TET1与Wnt基因在山羊胎儿发育早期的表达模式,并进行了相关性分析,填补了这些基因在山羊方面的研究空白;TET1与Wnt基因对山羊胎儿早期的发育和组织的形成是一个动态的调控变化过程;TET1基因表达与部分Wnt基因呈现显著正相关,部分呈现显著负相关;Wnt通路基因之间表达量呈现一定的相关性。这些数据为TET1与Wnt分子调控山羊早期胎儿发育的机制深入研究提供了参考。     

Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2

The sequence and the structure of DNA methyltransferase-2 (Dnmt2) bear close affinities to authentic DNA cytosine methyltransferases. A combined genetic and biochemical approach revealed that human DNMT2 did not methylate DNA but instead methylated a small RNA; mass spectrometry showed that this RNA is aspartic acid transfer RNA (tRNA(Asp)) and that DNMT2 specifically methylated cytosine 38 in the anticodon loop. The function of DNMT2 is highly conserved, and human DNMT2 protein restored methylation in vitro to tRNA(Asp) from Dnmt2-deficient strains of mouse, Arabidopsis thaliana, and Drosophila melanogaster in a manner that was dependent on preexisting patterns of modified nucleosides. Indirect sequence recognition is also a feature of eukaryotic DNA methyltransferases, which may have arisen from a Dnmt2-like RNA methyltransferase.     

猪GPAT基因SNPs位点分析和表达规律的研究

为了进一步探索谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶GPAT基因与肉质、风味性状的关系,采用PCR-SSCP方法分析其遗传多态性、采用Real time PCR方法分析其组织表达规律。在外显子1和14寻找到了3个单核苷酸多态位点,结果表明,各等位基因在民猪、大白、长白、杜洛克、北京黑猪和野家杂交猪中的分布存在着极显著的差异(P<0.01)。GPAT在所检测的12种组织中均表达,其中肝脏中表达量最高。研究结果为肉质和风味性状分子标记的确定提供了基础。     

Epigenetic reprogramming in mammalian development

DNA methylation is a major epigenetic modification of the genome that regulates crucial aspects of its function. Genomic methylation patterns in somatic differentiated cells are generally stable and heritable. However, in mammals there are at least two developmental periods-in germ cells and in preimplantation embryos-in which methylation patterns are reprogrammed genome wide, generating cells with a broad developmental potential. Epigenetic reprogramming in germ cells is critical for imprinting; reprogramming in early embryos also affects imprinting. Reprogramming is likely to have a crucial role in establishing nuclear totipotency in normal development and in cloned animals, and in the erasure of acquired epigenetic information. A role of reprogramming in stem cell differentiation is also envisaged. DNA methylation is one of the best-studied epigenetic modifications of DNA in all unicellular and multicellular organisms. In mammals and other vertebrates, methylation occurs predominantly at the symmetrical dinucleotide CpG (1-4). Symmetrical methylation and the discovery of a DNA methyltransferase that prefers a hemimethylated substrate, Dnmt1 (4), suggested a mechanism by which specific patterns of methylation in the genome could be maintained. Patterns imposed on the genome at defined developmental time points in precursor cells could be maintained by Dnmt1, and would lead to predetermined programs of gene expression during development in descendants of the precursor cells (5, 6). This provided a means to explain how patterns of differentiation could be maintained by populations of cells. In addition, specific demethylation events in differentiated tissues could then lead to further changes in gene expression as needed. Neat and convincing as this model is, it is still largely unsubstantiated. While effects of methylation on expression of specific genes, particularly imprinted ones (7) and some retrotransposons (8), have been demonstrated in vivo, it is still unclear whether or not methylation is involved in the control of gene expression during normal development (9-13). Although enzymes have been identified that can methylate DNA de novo (Dnmt3a and Dnmt3b) (14), it is unknown how specific patterns of methylation are established in the genome. Mechanisms for active demethylation have been suggested, but no enzymes have been identified that carry out this function in vivo (15-17). Genomewide alterations in methylation-brought about, for example, by knockouts of the methylase genes-result in embryo lethality or developmental defects, but the basis for abnormal development still remains to be discovered (7, 14). What is clear, however, is that in mammals there are developmental periods of genomewide reprogramming of methylation patterns in vivo. Typically, a substantial part of the genome is demethylated, and after some time remethylated, in a cell- or tissue-specific pattern. The developmental dynamics of these reprogramming events, as well as some of the enzymatic mechanisms involved and the biological purposes, are beginning to be understood. Here we look at what is known about reprogramming in mammals and discuss how it might relate to developmental potency and imprinting.     

Functional CpG methylation system in a social insect

DNA methylation systems are well characterized in vertebrates, but methylation in Drosophila melanogaster and other invertebrates remains controversial. Using the recently sequenced honey bee genome, we present a bioinformatic, molecular, and biochemical characterization of a functional DNA methylation system in an insect. We report on catalytically active orthologs of the vertebrate DNA methyltransferases Dnmt1 and Dnmt3a and b, two isoforms that contain a methyl-DNA binding domain, genomic 5-methyl-deoxycytosine, and CpG-methylated genes. The honey bee provides an opportunity to study the roles of methylation in social contexts.     

转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析

【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。     

Association of CYP19A1 gene polymorphisms with reproductive traits in pigs

Porcine reproductive traits are characterized by low heritability, making improvement by traditional selective breeding rather difficult. Molecular breeding offers powerful approaches to overcome previous limitations and is expected to generate economic benefits via progress in pig breeding. Cytochrome P450 family 19 subfamily A polypeptide 1(CYP19A1) gene is a key enzyme of estradiol biosynthesis that plays an important role in the establishment of gestation and maintenance of pregnancy. In this study, the sequence and structure characteristics of the porcine CYP19A1 gene was analyzed and expression patterns of CYP19A1 in different tissues of adult female pigs were detected. Fourteen single-nucleotide polymorphisms(SNPs) in the exons and introns of porcine CYP19A1 were identified and genotyped using the Sequenom Mass ARRAY platform, after which the allele frequency of each SNP was analyzed. The association between CYP19A1 SNPs and litter size and piglet birth weight was assessed in a crossbred pig population(n=375). The expression pattern of CYP19A1 revealed that it was highly expressed in the ovary, spleen, and uterus and lowly expressed in the other tissues. Moreover, one SNP, rs341891833, was significantly associated with piglet birth weight during the multiparity period(P0.01). We concluded that CYP19A1 could be used as a candidate molecular marker in breeding aimed at rapid improvement of the reproductive characteristics of pigs.     

用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制

【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨 ZBED6 在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪（ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪（ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析,比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Sus_scrofa10.2为参考序列,用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因,对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪（P＜0.05）,与ZBED6-WT猪相比,ZBED6-KO猪肌纤维的宽度较宽,结缔组织较少,ZBED6基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用;测序结果显示,各样本获得至少10 G的数据量,每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上,表明测序饱和度良好,测序数据真实可靠;对测序数据进行分析,筛选到 184个差异基因,其中上调的基因114个,下调的基因70个,注释的141个,未注释的43个;差异基因层次聚类分析显示,ZBED6-KO组（x1、x3、x6）的3个个体表达模式相似,ZBED6-WT组（x2、x4、x5）的3个个体表达模式相似;GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目,33条显著的pathway通路,差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和RhoA信号等相关的通路;qRT-PCR 检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】首次以ZBED6-KO巴马小型猪为模型,利用RNA-Seq技术探究了ZBED6敲除对心脏发育和功能的影响,丰富了ZBED6 对心脏发育和功能的研究。     

小鼠卵泡膜细胞成熟过程中Dnmts表达变化的研究

 【目的】揭示小鼠卵泡膜细胞成熟过程中DNA甲基转移酶（Dnmts）表达的变化,并初步探讨其可能的机制。【方法】对新生昆明白小鼠第3、5及8天（days post parturition,dpp3、dpp5和dpp8）的卵巢进行切片,经H.E染色,分别观察原始、初级、次级卵泡膜细胞的形成情况,统计各级卵泡的比例并对卵泡外缘的膜细胞进行计数;半定量PCR检测成熟膜细胞特异性表达基因CYP17A1及Dnmts转录水平在dpp3、dpp5、dpp8卵巢中的变化;免疫组化观察Dnmt1蛋白在dpp3、dpp5、dpp8小鼠卵巢中的分布情况。【结果】小鼠dpp3卵巢中的初级卵泡外缘存在“梭形细胞”;随出生后时间的推移,原始卵泡比例持续下降（P＜0.01）,次级卵泡比例持续升高（P＜0.01）,dpp3、dpp5初级卵泡比例无显著差异（P＞0.05）,而dpp8下降（P＜0.05）;初级卵泡周围“梭形细胞”数量的平均水平在dpp3和dpp5无显著差异（P＞0.05）,在dpp8上升（P＜0.05）;次级卵泡周围“梭形细胞”数量的平均水平在dpp3和dpp5无显著差异（P＞0.05）,在dpp8上升（P＜0.01）。CYP17A1转录水平在dpp3、dpp5极低且无显著差异(P＞0.05),在dpp8升高（P＜0.01）;Dnmt1s转录水平在dpp3、dpp5、dpp8持续升高（P＜0.01）;Dnmt1o转录水平在dpp5升高（P＜0.05）,在dpp8下降（P＜0.01）;Dnmt3a转录水平在dpp5升高（P＜0.01）,dpp3和dpp8转录水平无显著差异（P＞0.05）。Dnmt1免疫组化显示,卵泡颗粒细胞在dpp5、dpp8卵巢中着色呈阳性,dpp3则呈阴性;同时,“梭形细胞”在dpp3、dpp5卵巢中着色呈阴性,dpp8则呈阳性。【结论】膜细胞成熟可能导致Dnmt3a转录水平下降。Dnmt1s转录及表达水平在膜细胞成熟前较低,分化成熟后上调从而在膜细胞增殖过程中维持新建立的甲基化模式。     

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

 【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH（the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1 701 bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1 050 bp完整CDS（Coding Sequence,编码序列）区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4,白细胞介素-4）紧密连锁,LOD（Limit of Detection,检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。     

广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异分析

【目的】明确广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异,为进一步阐明大型猪与小型猪的体型形成机制提供理论依据。【方法】以1日龄的广西巴马小型猪和长白猪为研究对象,采集其四肢骨生长板软骨组织提取总RNA,反转录合成cDNA后用于扩增BMP2和FGFR3基因的编码区（CDS）序列,采用PCR-RFLP检测FGFR3基因SNP位点多态性,并通过实时荧光定量PCR分析BMP2和FGFR3基因在1日龄广西巴马小型猪和1日龄长白猪生长板软骨组织中的表达差异。【结果】1日龄广西巴马小型猪与1日龄长白猪的体型差异明显,其体重、体长和体高的差异均达极显著水平（P<0.01,下同）,股骨长的差异达显著水平（P<0.05,下同）。广西巴马小型猪和长白猪的BMP2基因CDS序列全长1188 bp,且2个品种猪的CDS序列完全一致;广西巴马小型猪和长白猪的FGFR3基因CDS序列全长808 bp,与NCBI已公布的FGFR3基因序列（XM_005666479.1）比对发现存在8个碱基突变位点及1个碱基缺失位点。广西巴马小型猪和长白猪共有5个错义突变位点,分别为A124G、C190G、A204C、C205A和C245T,另外3个突变位点是广西巴马小型猪A438G和C549T的同义突变及长白猪A752C的错义突变;碱基缺失位点为长白猪第328~330个碱基（GCA）缺失。FGFR3基因A2374G和C2620T位点的基因型及基因频率在广西巴马小型猪与长白猪间的分布差异极显著,对应的等位基因分布均不符合Hardy-Weinberg平衡,且2个基因座均处于连锁平衡状态。1日龄广西巴马小型猪生长板软骨组织中的BMP2基因相对表达量显著低于1日龄长白猪,而FGFR3基因相对表达量极显著高于1日龄长白猪。【结论】BMP2和FGFR3基因在猪的软骨和骨骼形成方面具有重要意义,其中,BMP2基因对猪骨发育起促进作用,而FGFR3基因对猪骨发育起抑制作用。广西巴马小型猪体型矮小与FGFR3基因高表达及BMP2基因低表达存在直接关联。     

印迹基因Igf2r的甲基化进程与兔卵母细胞直径关系的研究

本研究以3～4月龄兔为研究对象,收集卵母细胞,按直径将其划分为75～95μm、95～105μm、105～115μm3个组,通过亚硫酸盐测序法检测了印迹基因Igf2r的甲基化程度,并运用RT-PCR对Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3l、Lsh的表达量进行检测。结果表明,在3组卵母细胞内,Igf2r的甲基化比率依次为15.7%、60%、91.5%,甲基化程度随卵母细胞直径的增加而不断提高。     

猪繁殖候选基因ERK2的克隆、表达及基因多态分析

 【目的】ERK2基因在细胞增殖和分化调控以及启动卵巢排卵的分子信号等过程中发挥重要作用,是影响猪繁殖性状的重要候选基因。本试验对猪ERK2基因序列、基因结构、基因多态性及其表达规律进行初步研究。【方法】以大白猪为材料,采用RT-PCR方法克隆了猪ERK2基因,Real-Time PCR测定该基因在猪各组织器官中的分布,并对该基因的结构和多态性进行分析。【结果】从猪卵巢组织中克隆获得ERK2基因部分cDNA序列,长1 888 bp,包括一个1 080 bp的开放阅读框,编码359个氨基酸与预测的猪ERK2基因、已报道的人和小鼠等的ERK2基因高度相似;猪ERK2基因在各组织中表达广泛,其中脾脏是表达量最高的组织,在脂肪组织、前后腿肌中基本不表达;猪ERK2基因定位于14号染色体,全长在22 kb以上,包含9个外显子和8个内含子;对第2—9外显子及内含子外显子交界处的内含子序列进行序列突变检测,共检测到11个SNPs和1个插入缺失突变,但绝大部分的变异都是在内含子区域,仅有1个SNP发生于3′UTR区域。【结论】猪ERK2基因cDNA为1 888 bp,编码359个氨基酸残基;在猪各组织中广泛分布,以脾脏的表达量最高;该基因由9个外显子和8个内含子组成,基因保守性较高,共检测到11个SNP和1个插入缺失突变均不在编码区中。     

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立 及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。     

Development of a Porcine cDNA Microarray: Analysis of Clenbuterol Responding Genes in Pig (Sus scrofa) Internal Organs

Pig (Sus scrofa) fat accumulation can be reduced by feeding with high dosages of clenbuterol, but the molecular mechanism has not yet been explained. In our study, a porcine cDNA microarray representing 3 358 pig genes was successfully developed. This microarray is the first porcine DNA microarray in China and its false positive rate is 0.98%, which means the microarray platform is reliable. The microarray can be used to study gene expression profiles in multiple pig tissues because the present genes percentage of adipose, skeletal muscle, heart, liver, lung, kidney, and spleen were all more than 60%. This microarray was used to identify the genes responding to clenbuterol stimulation in pig internal organs, including heart, liver, lung, spleen, and kidney. Many genes were identified including enzymes involved in lipids metabolism (lipoprotein lipase up-regulated in liver, heart and lung, ATP-citrate lyase and carnitine palmitoyltransferase II precursor up-regulated in liver, succinyl-CoA up-regulated in lung, mitochondrial malate dehydrogenase down-regulated in spleen), and signaling pathway genes (cAMP-protein kinase A signaling pathway was found up-regulated in liver, heart, lung, and kidney as reported previously, while transforming growth factor was found down-regulated in heart and lung). However, no common gene responding to clenbuterol administration was found in all tissues. The expression levels of 14 genes were analyzed using real-time PCR with 82.1% of them induced to express similar magnitudes as in the microarray analyses. This work offers some understanding of how clenbuterol so effectively reduces pig adipose accumulation on the molecular level.     

印记基因SNRPN、NDN和UBE3A在初生仔猪及胎盘中的表达谱分析

[目的]分析印记基因SNRPN、NDN和UBE3A在初生仔猪中的表达情况,从而探讨它们和猪生长发育的关系。[方法]采用荧光定量PCR方法,检测SNRPN、NDN、UBE3A基因在出生3 d仔猪的13种组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉、大脑、垂体、小肠、胃、膀胱、脂肪、下丘脑)及不同时期的胎盘中的表达水平。[结果]SNRPN、NDN、UBE3A基因在13种组织中都有表达,SNRPN和NDN基因在下丘脑中表达量极显著(P<0.01)高于其他被测组织,UBE3A基因在肺、小肠和下丘脑中的表达量显著(P<0.05)高于其他被测组织,SNRPN基因在下丘脑中的表达量极显著(P<0.01)高于NDN、UBE3A基因,在梅山猪和杜洛克猪不同时期胎盘中稳定表达。[结论]SNRPN、NDN和UBE3A基因都在下丘脑中高表达,对神经系统的生长发育有重要的影响;同时该研究为这3种基因在猪中的功能研究提供了基础。     

天津市家庭农场养殖粪污耐药基因赋存特征及风险评估

为了解家庭农场养殖粪污中抗生素耐药基因(ARGs)的赋存特征及潜在风险,本研究选取天津市蓟州区22家典型的家庭农场,采用实时荧光定量PCR方法,考察了不同种类畜禽粪污中ARGs的污染特征及其对周边农田土壤的影响。结果表明,磺胺类、四环素类、喹诺酮类和大环内酯类耐药基因在家庭农场畜禽粪污中普遍存在,且四环素类耐药基因tetO、tetQ、tetW和大环内酯类耐药基因ermB含量最为丰富,同时检出了blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC等与人类健康密切相关的β-内酰胺类抗生素耐药基因(bla基因)。此外,还发现如下规律:相比于猪场和牛场,鸡场粪污中的ARGs污染程度更为严重;在不同生育阶段的猪群中,母猪粪污中的多数耐药基因相对丰度要显著高于仔猪和育肥猪(P<0.05);畜禽粪肥施用可显著增加土壤环境中ARGs的丰度(约8~18倍)(P<0.05)。本研究表明,家庭农场畜禽养殖粪污中耐药基因污染严重且普遍,同时随着粪污还田进入土壤环境增大环境风险,最终可能会通过污染农作物危害人类健康,应引起高度重视。