CRISPR/Cas9系统研究进展及应用

CRISPR/Cas9是目前应用广泛的基因组编辑工具,该系统利用一段RNA引导Cas9核酸酶可对多种细胞及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰,具有操作简单、作用高效等优点。Ago是另一类核酸内切酶,具有良好的应用潜力。从CRISPR/Cas9的发展现状、结构基础、作用机制、改进后的基因编辑机制及基因编辑技术的应用等方面进行了综述,讨论其存在的问题,并提出相应对策。     

CRISPR/Cas9技术发展及其应用进展

概括了CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理,分析了该系统的不足,重点阐述了该技术在林木基因组编辑中的应用,并对CRISPR/Cas9系统的未来研究趋势进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术介导SST基因敲除细胞的制备

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA (sgRNA),用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。     

利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

[目的]随着人们生活水平的不断提高,具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎.水稻的香味性状主要受第8染色体上的BADH2基因控制,该基因突变造成稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉的积累而产生香味,加速香稻培育的进程.[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以适宜江西种植的粳稻台南11为研究材料,在BADH2基因...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

[目的]生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据.[方法]根据O...     

CRISPR／Cas9在烟草遗传育种中的应用

主要从CRISPR/Cas9系统的基本原理、应用及其存在的问题等方面进行了综述,并对该技术如何应用于烟草遗传育种以及分子改良研究进行了展望。     

CRISPR/Cas9技术在家禽育种方面的应用

作为一种重要的基因工程技术,基因编辑自出现以来一直倍受关注.近年来,基因编辑技术发展更为迅速,从锌指核酸酶技术(ZFN)的开发利用到转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术的熟练运用,再到规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的发现,基因编辑技术在不断地自我更新和完善的过程中推动着生命科学的发展和进步.综述了...     

CRISPR/Cas9系统及其在作物育种中的应用

基因编辑是一项对目的基因进行修饰的新技术,由成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR associated,Cas)组成的系统(CRISPR/Cas)为新一代基因编辑技术,其中Cas9蛋白与CRSPR结合形成的编辑系统CRISPR/Cas9因其简单易操作的特性已广泛应用于植物基因组编辑,发展潜力巨大.文章论述了CRISPR/Cas9系统的作用原理、发展历程及在植物基因组中的定点编辑效应,并分析CRISPR/Cas9在水稻、小麦、玉米等作物育种中的应用现状,发现其在改良水稻产量和质量相关性状、小麦白粉病抗性及玉米乙烯敏感等性状上效果明显.在今后的研究中,应针对不同作物的育种目标,深入了解目标基因的功能作用来设计相应的操作方案,并提高该系统对作物目的基因改良的效率,加强其安全性等,以促进基因编辑在作物育种中的应用,加快育种进程.     

CRISPR/Cas9在生物医学疾病模型中的应用

CRISPR/Cas9系统的发展改变了基因编辑领域,并可以作用于绝大多数细胞类型和生物体。此外,CRISPR/Cas9可应用于调节内源基因表达、表观基因组编辑、单链RNA的编辑和高通量基因筛选,丰富了基因功能研究的手段,也产生了大量基于此系统的基因模型。本文介绍了CRISPR/Cas9工作原理和优点,并综述了其在疾病模型中的应用,以期加深人们对疾病病因的了解和开发新的治疗手段。     

通过CRISPR/Cas9技术打靶兔Myostatin基因

细菌和古生菌利用自身的获得性免疫系统(CRISPR)抵御外来侵略,使外源DNA降解。为了基因突变兔子成纤维细胞的Myostatin基因,研究构建了CRISPR和g RNA质粒,当Cas9与g RNA摩尔数之比分别为1∶2、1∶1时进行转染到兔子成纤维细胞中,结果显示有打靶效率差异,经过鉴定均有碱基突变。结果表明:利用(CRISPR/Cas9)系统可成功突变目的基因。     

CRISPR/Cas9技术及其应用于基因敲除研究进展

CRISPR/Cas9是一种高效率、简单操作、低成本的基因编辑工具,近年来广泛应用于动物、植物和微生物基因敲除研究,为深层次地应用于医学研究奠定了基础。概述CRISPR/Cas9技术在动物、植物和微生物的基因敲除中的研究进展,并对其深入研究进行展望。     

应用CRISPR/Cas9 编辑广东 小耳花猪MSTN 基因

MSTN基因是肌肉生长抑制基因,破坏MSTN基因的表达成为提高畜禽肌肉产量的有效途径。通过应用CRISRP/Cas9编辑技术对广东小耳花猪MSTN基因的外显子区域进行编辑,破坏MSTN基因的读码框来抑制其表达,从而提高广东小耳花猪的肌肉产量。共设计了6条靶向MSTN基因3个不同外显子的gRNA,经过T7E1酶切检测和TA克隆分析,发现其中3条gRNA能够发生有效切割,其中切割效率最高的达28.3%,最低为17.0%。gRNA1-1和gRNA3-3突变的广东小耳花猪PEF细胞系,突变效率均在50%以上,其中三号外显子上突变位点的突变率达到61.5%。试验结果为后续进行体细胞核移植,生产MSTN基因编辑的广东小耳花猪奠定了基础。     

Reduction in cadmium accumulation in japonica rice grains by CRISPR/Cas9-mediated editing of OsNRAMP5

Cadmium (Cd) intake is harmful to human health and Cd contamination in rice grains represents a severe threat to those consuming rice as a staple food. Knockout of Cd transporters is a promising strategy to reduce Cd accumulation in rice grains. OsNRAMP5 is the major transporter for Cd and manganese (Mn) uptake in rice. Nevertheless, it is uncertain whether knockout of OsNRAMP5 is applicable to produce low Cd rice without affecting plant growth and grain yield. In this study, we adopted CRISPR/Cas9-based gene editing technology to knock out OsNRAMP5 in two japonica varieties. We generated three independent transgene-free osnramp5 mutants and investigated the effect of osnramp5 mutations on Cd accumulation and plant growth. Hydroponic experiments showed that plant growth and chlorophyll content were significantly reduced in osnramp5 mutants at low Mn conditions, and this defective growth in the mutants could be fully rescued by supply of high levels of Mn. Cd and Mn accumulation in both roots and shoots was markedly reduced in the mutants compared to that in wild-type plants. In paddy field experiments, although Cd in flag leaves and grains was greatly reduced in osnramp5 mutants, some agronomic traits including plant height, seed setting rate, and grain number per panicle were affected in the mutants, which ultimately caused a mild reduction in grain yield. The reduced plant growth in the mutants can be attributed to a marked decrease in Mn accumulation. Our results reveal that the manipulation of OsNRAMP5 should be treated with caution: When assessing the applicability of osnramp5 mutants, soil pH and soil water content in paddy fields need to be taken into consideration, since they might affect the levels of available Mn in the soil and consequently determine the effect of the mutation on grain yield.     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

[目的]OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程.利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11 (ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻...     

CRISPR/Cas9技术在园艺作物中的研究进展

【目的】 回顾近年来基因编辑技术在园艺作物中的研究进展,为园艺作物的基础研究与品种培育提供参考。【方法】 从国内外文献资料中收集查阅CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中的研究报道,对其分析汇总。【结果】 传统育种手段难以满足园艺作物对产量和品质日益增长的需求,CRISPR/Cas9技术为其品种改良开辟新的道路,改变园艺作物育种格局,促进其在抵御生物胁迫,响应非生物胁迫,提高果实品质和作物驯化。【结论】 CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中是育种工作不可或缺的关键性技术。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9技术在农作物应用中的局限及改进

基因编辑技术是一种可直接对DNA序列进行稳定、精准改造的技术,其中CRISPR/Cas9技术以简便、高效、经济等优势脱颖而出。在农作物中,CRISPR/Cas9技术被广泛应用于作物遗传育种、植物基因改造、农作物品种改良等多个方面,给农作物领域带来巨大机遇。但机遇与挑战并存,该技术在实际应用中亦遇到一些困难。因此,本文围绕CRISPR/Cas9技术的原理、局限及改进方案进行综合阐述,以期为CRISPR/Cas9技术在农作物中的进一步应用提供理论基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展及其在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行定向编辑,在植物基因功能研究和遗传改良中具有巨大的潜在应用价值,因其具有高效、操作便捷及成本低的特点,成为当前基因组编辑技术的主流。概述了CRISPR/Cas9系统的起源、分类、作用机制及其在农作物和林木基因功能验证和遗传改良中的应用,并对未来需要完善的相关问题和发展趋势进行了探讨。     

CRISPR/Cas系统在活细胞染色体成像中的应用

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins)是细菌抵抗外来入侵的一种自适应免疫机制,利用CRISPR/Cas9系统可实现双链DNA的剪切并诱导宿主细胞DNA修复机制,从而达到靶向编辑基因的目的。核酸酶失活的Cas9(Nuclease-deactivated Cas9,d Cas9)耦联效应分子可以调控靶标结合位点附近基因的表达、表观遗传修饰及特异染色体区域标记。目前已开发出多种CRISPR/Cas9系统,可对活细胞中重复或低重复序列基因位点进行实时多位点同步成像,广泛应用于动物和植物细胞中。基于CRISPR/Cas系统的活细胞染色体成像技术为研究活细胞染色体动力学和三维染色体结构提供了全新角度。本研究针对CRISPR/Cas系统的生源机制及其在活细胞成像的应用和发展现状进行概述,以期为该领域的相关研究提供参考。     

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。