猪链球菌2型IMPDH基因功能结构域的研究

在猪链球菌毒力相关基因orf2和mrp之间发现一个新的开放阅读框,经酶活性染色试验证实该阅读框编码的蛋白具有次黄嘌呤核苷酸脱氧酶(IMPDH)活性,该阅读框共计957 bp,编码319个氨基酸.经Interpro和PHD软件分析,推测该蛋白的功能结构域存在于9～798 bp基因片段所编码的多肽中,特对这790个碱基依次缺失,以找寻酶的催化部位和底物结合部位.4个缺失基因和全长基因经过基因克隆,表达出5种相应的蛋白.免疫印迹证实这5种蛋白可被猪链球菌2型(SS2)的抗血清识别,且其中的4种蛋白含有IMPDH单抗(1A8)识别表位;通过活性染色,初步确定了SS2中IMDPH的催化部位和底物结合部位.     

猪链球菌2型灭活疫苗对小鼠的免疫效果评价

在前期筛选出2株毒力强、抗原性好、遗传稳定的猪链球菌2型(SS2)疫苗菌株(HF2、HF3株)并分别制成灭活疫苗(采用ISA 201 VG矿物油佐剂)的基础上,进一步与SS2商品化灭活疫苗(HA9801株,铝胶佐剂)同步免疫小鼠,利用间接ELISA、流式细胞术、免疫攻毒试验、细菌定植试验和病理组织学观察等方法测定小鼠血清中IgG抗体效价,细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1),外周血中CD4⁺/CD3⁺、CD8⁺/CD3⁺ T细胞亚群含量,攻毒保护率,组织荷菌数和病理组织变化等指标。结果显示,二免7 d后,HF2、HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组的血清IgG抗体效价分别为1:25 600、1:12 800、1:25 600;HF2灭活疫苗组的IL-4、IL-10含量显著高于HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组,IFN-γ、TNF-β含量显著高于HF3灭活疫苗组,但MCP-1含量显著低于HF3灭活疫苗组;HF2和HF3灭活疫苗组的CD4⁺/CD3⁺ T细胞比率均显著低于HA9801商品化灭活疫苗组,但CD8⁺/CD3⁺ T细胞比率差异不显著;HF2、HF3灭活疫苗和HA9801商品化灭活疫苗对小鼠的攻毒保护率均为100%;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、脾脏组织荷菌数显著低于HF3灭活疫苗组;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、肾、脾脏病理变化较HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组轻微。综合结果表明,由SS2(HF2株)制备的ISA 201 VG佐剂灭活疫苗免疫小鼠后不仅可产生较强的免疫应答,还可完全抵抗强毒株的攻击。     

毛蕊花糖苷抑制2型猪链球菌的溶血素蛋白活性而降低其小鼠致病性

为了探究天然化合物毛蕊花糖苷(verbascoside, VBS)对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, SS2)致病性的作用,本研究通过测定最低抑菌浓度、绘制细菌生长曲线及红细胞溶血试验,发现低浓度下的毛蕊花糖苷不影响猪链球菌的正常生长,但对其溶血活性有显著抑制作用;免疫印迹试验表明,毛蕊花糖苷不影响2型猪链球菌分泌溶血素蛋白(suilysin, SLY);通过分子对接预测毛蕊花糖苷可与SLY的2个氨基酸残基(SER-388、GLN-441)形成3条氢键结合从而使毛蕊花糖苷嵌入SLY蛋白的第4结构域,同时体外溶血活性试验进一步证实毛蕊花糖苷可直接抑制SLY介导的溶血活性;最后,小鼠体内试验结果表明,毛蕊花糖苷可明显提高2型猪链球菌感染小鼠的存活率。综上,毛蕊花糖苷在不影响2型猪链球菌生长活性的情况下,可通过抑制溶血素活性来降低2型猪链球菌对小鼠的致病性。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因表达文库的构建

为构建用于筛选Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因的融合基因表达文库.采用自杀载体pGP704为骨架,将无启动子的cat基因作为报告基因克隆到自杀载体pGP704上,构建报告质粒pGP704-cat;将Ⅱ型猪链球菌基因组DNA的500～1 000 bp酶切片段克隆到报告质粒pGP704-cat中cat基因的上游,转化受体菌获得融合基因文库;将文库质粒电转化Ⅱ型猪链球菌,得到融合基因表达文库.结果表明:构建的融合基因表达文库以氯霉素作为选择标记,经体外培养,获得2%的菌株具有氯霉素抗性,融合基因表达文库存在可以启动cat基因表达的启动子序列,cat基因在体外可以表达.构建的融合基因表达文库可以用于Ⅱ型猪链球菌体内诱导基因的筛选.     

猪链球菌2型CVCC606株免疫相关抗原的纯化及其免疫保护研究

以猪链球菌2型CVCC606免疫断乳仔猪制备高免血清,纯化血清IgG,制备亲和层析柱,亲和纯化其免疫相关抗原;SDS-PAGE分析抗原的组成,研究其对猪链球菌2型CVCC606攻击的BALB/c小鼠的免疫保护作用。结果表明:以亲和层析方法纯化获得的免疫相关抗原分子量集中于29.0~97.2 kD,对5倍LD50剂量的猪链球菌CVCC606攻击的BALB/c小鼠的保护率为60%,呈现了部分的保护作用。所获得的免疫相关抗原中含有保护性抗原。     

用斑马鱼检测猪链球菌2型的致病力

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）菌株致病力各异，以斑马鱼为实验动物，建立了较为简便可靠的SS2致病力检测方法。【方法】选用1 005尾AB系斑马鱼（Danio rerio）以检测SS2不同分离株的致病力。检测8株基因型均为mrp+ef+、对猪有致病力的SS2菌株。【结果】结果斑马鱼接种菌株12 h后呈败血症病变，96 h内对斑马鱼的半数致死量（LD50）在5.36×103至5.01×104 cfu之间。上述接种菌株的斑马鱼均从体内重新分离到接种菌。同时检测1株基因型为mrp-ef-、对猪无致病力的SS2菌株，斑马鱼接种后96 h内不表现任何病变，亦不出现死亡，对斑马鱼的LD50>106 cfu。SS2有毒力株和无毒力株对斑马鱼的LD50差异极显著（P＜0.01）。【结论】斑马鱼可作为研究猪链球菌2型菌株感染的动物模型。     

猪链球菌2型福建株的分离鉴定

从临床表现为败血症的濒死病猪肝脏、肺脏、淋巴结中分离到一株链球菌,进行形态学、生化特性、小白鼠感染试验及PCR鉴定和CPS2 J序列测定.结果表明:该分离菌的形态、培养和生化特性基本符合链球菌的特点;人工感染试验显示,小白鼠腹腔接种0.2 mL分离菌培养物不发病,但接种1 mL能在48 h内致小白鼠死亡,并能从脏器中分离到接种菌;分离菌的PCR扩增产物与猪链球菌2型阳性参考菌株JA070109大小一致、长度为675 bp的特异性条带,其PCR产物的核苷酸序列与GeneBank上公布的猪链球菌2型不同菌株的同源性高达98%-100%.可见,该分离菌为猪链球菌2型,并首次证实福建存在猪链球菌2型.     

猪链球菌2型在小型猪模型体内的动态分布

实验采用SPF小型猪建立猪链球菌2型的动物模型,将14头SPF小型猪随机分为实验组和对照组,实验组肌肉注射2 mL的1×109 CFU.mL-1菌液,对照组注射2 mL无菌培养基。攻毒后利用细菌培养和PCR技术定期检测体内血液和组织中的细菌动态分布情况。实验发现SS2侵入血液的速度很快;扁桃体是该菌的定植器官,SS2对肝脏、肾脏等实质器官的黏附性无明显差异;只有出现神经症状及死亡仔猪,才能从脑组织中分离到SS2,说明细菌突破血脑屏障,进入大脑可能是引发脑膜炎的前提。试验为研究该病的致病机理提供了依据。     

链球菌与猪链球菌病

由链球菌引起的猪链球菌病,严重影响养猪业的发展,造成巨大经济损失,并引起人员感染致死。为进一步加强对本病的了解,采取有效防治措施,本文就链球菌及猪链球菌病的流行、临床症状、剖检变化、诊断、防治等方面作一概述。     

屠宰生猪体内猪链球菌2型带菌情况调查

应用猪链球菌2型定型PCR方法,对从福建省3个屠宰场采集的临床健康的生猪鼻咽拭子样本共121份进行了检测,同时对阳性样本进行了细菌分离鉴定及毒力基因检测。结果显示：121份样本中有17份为阳性,检出率为14．0％（17／121）,其中福州地区检出率为10．9％（7／64）,宁德地区检出率为11．8％（4／34）,莆田地区检出率为26．1％（6／23）。3株分离菌cps2J基因PCR特异性扩增产物大小均为675bp,其核苷酸序列与Genebank中猪链球菌2型参考菌株的同源性高达98％～100％,毒力基因型为gdh^＋／cps2J^＋／mrp^＋／ef^-／sly^-／fbps^＋／orf2^＋。调查结果表明,福建省福州、宁德、莆田等地区生猪群中均存在猪链球菌2型携带者,所分离到的3个猪链球菌2型菌株其毒力基因型为新的基因型。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

湖北地区猪链球菌2型的鉴定及生物学特性研究

以湖北荆州地区疑似猪链球菌病的病猪为研究对象,经病料采集、细菌分离培养、纯化、染色、镜检、生化鉴定、血清学试验和PCR检测,确定该病猪为猪链球菌2型病例。经药敏试验筛选出了环丙沙星、阿莫西林和头孢唑肟钠为其敏感药物;经动物攻毒试验复制出同样疾病,表明猪链球菌2型对湖北地区猪具有很强的致病性。     

猪链球菌2型病的研究现状及防治措施

猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病病原,对猪链球菌2型的流行病学、毒力因子、检测方法和疾病防治等方面进行了综述。     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型GN061215生物学特性及蛋白质表达的影响

为了了解次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)对猪链球菌2型GN061215致病力的影响机制,利用同源重组技术,敲除猪链球菌2型GN061215的impdh基因,重组后的GN061215命名为GN061215(△IMPDH),比较GN061215与GN061215(△IMPDH)培养特性、生化特性、致病力以及基因转录水平差异。结果显示impdh基因敲除后,引起GN061215生长曲线迟缓期延长,降低了GN061215生长曲线平台期OD600峰值,同时截短了GN061215菌株成链长度;GN061215、GN061215(△IMPDH)对46种代谢底物利用能力一致,对2种代谢底物利用存在差异;GN061215(△IMPDH)对Balb/c小鼠的致病力较GN061215菌株有一定程度的下降。SDS-PAGE显示GN061215(△IMPDH)菌体的粗提蛋白质条带较GN061215有显著减少;基因芯片比较GN061215、GN061215(△IMPDH)基因转录差异发现,下调基因中存在36个关联核糖体大、小亚基合成的基因,而在上调基因中不存在该类基因,表明impdh基因的丢失影响了GN061215菌株核糖体大、小亚基的合成,进而显著减少了GN061215菌株菌体蛋白质的表达,这可能与GN061215菌株毒力的下降有关。     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失株的构建

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素（cat）选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H（△IMPDH）对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H（△IMPDH））对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108 CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108 CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H（△IMPDH）,并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。     

猪链球菌2型制苗用菌株的筛选

为筛选出致病力强、抗原性优良、遗传性状相对稳定的猪链球菌2型(Streptococcus suis 2,SS2)制苗用菌株。以6株临床分离SS2强毒株为受试菌株(编号为HF1、XC1、HF2、HF3、BZ1、BB1),通过改良寇氏法测定菌株半数致死量(LD₅₀),利用ELISA检测新西兰大白兔和昆明鼠血清的抗体效价测定反应原性,昆明鼠及斑马鱼免疫攻毒试验测定免疫原性,同时连续传代培养受试菌株,检测第10代、20代和30代菌株的半数致死量(LD₅₀)、血清抗体效价和免疫保护率。结果显示,BB1、BZ1、XC1、HF1、HF2和HF3对昆明鼠的LD₅₀分别为3.72×10⁹、3.31×10⁸、1.58×10⁹、1.00×10⁹、5.01×10⁸和3.24×10⁸ CFU·mL^-1;对斑马鱼的LD₅₀分别为3.31×10³、0.93...     

猪链球菌2型基因芯片检测技术的建立

选取猪链球菌2型的cps2J基因设计引物和探针,通过PCR扩增Cy3标记的DNA片段与固定于芯片上的探针进行杂交,并将杂交完毕的芯片进行信号扫描分析,根据荧光信号的强度来确定是否存在猪链球菌2型。结果表明,采用浓度为5μmol/L的探针与PCR产物杂交30min即可得到清晰的荧光信号,表明基因芯片检测技术是一种灵敏度高、特异好的检测方法。该方法的建立可以快速有效地对猪链球菌2型做出诊断,具有较好的应用前景。