检测猪瘟病毒E0抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

应用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒的E0基因片段,并将其分别克隆到pGEX-4T-1与pET-28a载体,获得了pGEX-4T-1-E0与pET-28a-E0重组表达质粒。以IPTG诱导表达的纯化GST-E0和His-E0重组蛋白为包被抗原,建立检测猪瘟病毒E0抗体的间接ELISA方法。采用方阵滴定法,确定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分别为50 ng/孔和100 ng/孔,血清最佳稀释度为160倍。对80份猪瘟阴性血清样品进行了检测与统计学分析,确定出GST-E0和His-E0重组蛋白的间接ELISA方法的临界值分别为0.167和0.176。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,本试验建立的基于GST-E0和His-E0蛋白的间接ELISA方法均具有特异、敏感和重复性好等优点。应用GST-E0和His-E0的间接ELISA方法及IDEXX E2抗体检测试剂盒平行检测88份猪血清样品,结果显示基于GST-E0和His-E0的间接ELISA方法与IDEXX试剂盒的符合率分别为78.41%和84.09%。以猪瘟病毒接毒细胞为抗原,应用免疫荧光试验(IFA)对His-E0间接ELISA和IDEXX检测试剂盒检出的阴性与阳性血清样品进行了验证,结果IFA与His-E0间接ELISA方法的符合率为93.18%;IFA与IDEXX试剂盒的符合率为90.91%,表明本试验所建立的基于His-E0的间接ELISA方法用于检测猪瘟抗体优于IDEXX公司检测E2抗体的试剂盒。该方法为鉴别E2亚单位疫苗免疫后的猪群中是否存在野毒感染提供了技术手段。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

以纯化的猪瘟病毒（CSFV）重组E2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDEXX ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的E2-PPA-ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2 000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD₄₅₀≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。     

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原ELISA方法的建立及应用

应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D₄₉₀值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。     

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体检测试剂盒(ELISA)的研制

为建立检测严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)血清总抗体的双抗原夹心ELISA方法并进行初步试用.通过原核表达得到SFTSV-NP重组蛋白,以该蛋白作为ELISA的包被和酶标记抗原,确定抗原的最佳包被浓度和血清稀释度,优化各项试验条件,在此基础上研制试剂盒,并对试剂盒的重复性、特异性等方面进行研究.结果发现抗原最适包被浓度为4.0μg/ml,血清的最佳稀释浓度为1:40,重复性试验表明批内和批间的变异性都低于10﹪.该试剂盒敏感性高、特异性强、重复性良好,可应用于SFTSV的研究和临床检测.     

牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种简单快速、敏感特异、高通量的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体检测方法,采用原核表达方法对BVDV E2基因中免疫原性强的1段序列进行截短表达,获得了具有良好反应活性的重组E2蛋白,以重组E2蛋白为包被抗原建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法检测牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清均为阴性,检测BVDV抗体的灵敏度可达1∶12 800,批内和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%,与中和试验的符合率为94.44%。应用该方法检测国内外5个生产厂家的53批次细胞培养用牛血清样品,阳性污染率达39.62%;检测589份临床牛血清样品,阳性感染率为34.80%。研究表明,建立的BVDV重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和适用性,为BVDV感染的监测提供了重要工具。     

牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用sf9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛病毒性腹泻病毒P80蛋白抗原,经纯化鉴定后将P80蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的P80抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛病毒性腹泻病毒抗体快速诊断试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒同时检测80头份牛血清,阳性结果符合率为86.7%,阴性结果符合率为100%,总符合率为95%。该试纸条可用于临床牛病毒性腹泻病毒抗体的诊断和检测。     

重组M蛋白间接ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组M蛋白作包被抗原,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为3.5μg/mL,37℃1h加4℃过夜,血清(1:40)和酶标SPA(1:80)分别在37℃温育1h,加底物溶液常温显色5min。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体间接ELISA方法的建立

建立了检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,旨在为PEDV感染检测与免疫效果评价提供技术手段。以重组PEDV结构蛋白(S1蛋白)作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度、封闭液、稀释液以及待测血清和酶标抗体的最佳工作浓度,建立了PEDV IgA抗体检测间接ELISA方法。进而检测方法的特异性、批内与批间重复性,评价建立方法与国外试剂盒的符合率,分析ELISA检测血清特异性IgA抗体水平与中和抗体的相关性。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,封闭液和抗体稀释液为含5%犊牛血清的PBS,待检血清和酶标抗体的工作浓度分别为1∶40与1∶1 500倍稀释。结果表明,该ELISA能够特异地检测PEDV抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等病毒的抗血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数低于10%,与现有试剂盒的总符合率为94.8%,血清特异性IgA抗体水平与中和抗体呈正相关(r=0.69,P<0.001)。