甘蔗核苷二磷酸激酶（NDPK1）基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆了甘蔗核苷二磷酸激酶基因全长cDNA,并用荧光定量PCR分析该基因的表达情况.结果表明:克隆得到的cDNA片段长度为686 bp,包括1个450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,GenBank登录号为JQ712580.甘蔗与高粱NDPK基因cDNA序列的同源性为96％,氨基酸序列同源性为98％;该基因推导的蛋白分子量大小为16.83 ku,等电点为6.58,疏水性分值在-2.089～2.033;蛋白二级结构中α-螺旋占44.3％,随机卷曲占24.83％,延伸链占20.13％,β-转角只占10.74％.实时荧光定量分析结果表明,随着甘蔗干旱胁迫时间的延长,NDPK1基因表达均呈先升高后降低的趋势,30h达最大;在处理后的18、30、40h,PEG与PEG+Si处理的NDPK1基因的表达量有显著差异.     

芒果类黄酮磺基转移酶基因克隆及表达分析

利用前期芒果逆境差异显示的基因数据设计引物,从四季芒基因组DNA和cDNA中克隆了1条长为1208 bp的基因片段。生物信息学分析发现,该基因属于类黄酮磺基转移酶(flavonoid sulfotransferase)基因,在第71-334个氨基酸中包含一个保守的Sulfotransferase结构域,命名为芒果类黄酮磺基转移酶基因(MiST)。该基因编码341个氨基酸,分子量为85.14 ku,等电点为5.09,不含内含子,在不同芒果品种之间其核苷酸和氨基酸序列均高度保守。半定量表达模式分析显示,该基因在四季芒茎、叶、花和果中均有表达,但在谢花后20 d的小果和谢花后40 d的中果中的表达量较高,表明该基因可能与芒果果实中黄酮的生物合成有关。     

稻瘟病菌NAD(H)激酶的生物信息学及表达分析

对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)全基因组中可能的NAD(H)激酶进行生物信息学和表达分析。结果表明,该菌含有3个可能的NAD(H)激酶,均具有保守的ATP-NAD激酶结构域;系统进化分析显示,NAD(H)激酶随着物种的进化而进化,但重要的功能结构域相对保守;MoPOS5在稻瘟病菌各生长发育阶段和致病过程中都有稳定转录,表明其在维持正常的生长发育及定殖扩展过程中扮演着十分重要的角色。     

芒果MiCOL6基因的克隆及其生物信息学和表达分析

CONSTANS（CO）是光周期途径的核心调控因子,其可以整合光质和生物钟输出的信号调控植物成花。在前期转录组研究的基础上,设计基因特异性引物,通过RT-PCR扩增得到芒果的1个CO基因的cDNA全长,序列长度为678 bp,根据与拟南芥CO家族基因的相似性,将其命名为MiCOL6。生物信息学分析显示,该基因编码226个氨基酸,分子量为26.88 kDa,等电点为4.85,属于亲水性的非分泌蛋白。保守结构域和进化树分析显示,该基因仅含1个CCT结构域,属于CO基因家族的第4组;二级结构分析表明,该蛋白主要以无规卷曲和α-螺旋为主;亚细胞定位预测显示该蛋白定位在细胞质膜上的概率最大;不同花发育时期表达模式分析表明,MiCOL6基因在杧果的花芽分化期表达量最高。本研究结果为进一步研究芒果MiCOL6基因在芒果中的功能提供理论基础。     

茶树CssHSP18.1基因克隆及表达分析

sHSPs基因家族可编码一类小分子的热激蛋白,广泛分布于植物中,具有分子伴侣的功能,在植物抵抗逆境胁迫中起着重要作用。通过基因克隆的方法,获得1个茶树CssHSP18.1基因的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,其全长480 bp,编码159个氨基酸。生物信息学分析表明,CssHSP18.1蛋白含有1个典型HSP20结构域,相对分子质量约为18.25 kDa,等电点为5.68,偏酸性,与栎和苹果亲缘关系最近,无信号肽与跨膜结构。RT-qPCR分析表明,CssHSP18.1在甘露醇（D-Mannitol）处理下表达量低于对照组;γ-氨基丁酸（GABA）能促进该基因的表达,在处理后1 h时表达量达到峰值;吲哚乙酸（IAA）和聚乙二醇（PEG 6000）处理后,CssHSP18.1在0.5 h时表达量最高,即GABA、IAA、PEG 6000均可诱导CssHSP18.1的表达。为获得CssHSP18.1可溶性蛋白,构建了pET-28a-CssHSP18.1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及IPTG（异丙基- -D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导浓度进行优化。结果显示,CssHSP18.1蛋白最佳表达菌株为BL21（DE3）,最佳诱导温度和IPTG浓度分别为30℃和1.2 mmol·L^-1。最后,采用Western blot对表达的CssHSP18.1蛋白进行验证。本研究为进一步揭示CssHSP18.1基因的生物学功能提供依据。     

芒果乙烯响应转录因子MiERF113基因的克隆及表达分析

芒果（Mangnifera indica L.）是著名的热带水果,深受消费者的喜爱。我国是世界第二大芒果生产国,其中广西为全国最大的芒果产区。芒果是典型的呼吸跃变型水果,其果实在采摘后因乙烯大量释放容易软化腐烂,导致货架期短,影响产业的发展。乙烯响应转录因子（ethylene response factor, ERF）是乙烯信号通路中的关键基因,参与果实内源乙烯合成的信号转导。为了探究ERF在芒果果实采后成熟调控的作用机制,以‘台农1号’芒果为研究对象,依据前期完成的芒果转录组数据结果,筛选并克隆得到1个ERF基因（MiERF113）,利用生物信息学方法分析MiERF113的基本理化特征、保守结构域、蛋白质结构、进化关系等;利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时期的特异性表达进行分析。结果表明：MiERF113基因的开放阅读框（ORF）长度为681 bp,编码227个氨基酸,预测蛋白质分子量为25.61 kDa,理论等电点（pI）为6.07,总平均亲水性为-0.883,有32个磷酸化位点,无跨膜螺旋结构,无信号肽。蛋白质结构域预测MiERF113蛋白仅含有1个保守的AP2结构域,且该结构域中第14和19位氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸,符合ERF亚家族的典型结构特征。将芒果与拟南芥、猕猴桃、阿月浑子、苹果、柑橘和茶树的ERF氨基酸序列进行进化分析,发现MiERF113与阿月浑子ERF113的同源性较高,亲缘关系最近。利用qPCR检测MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时间果皮和果肉部位的表达情况,结果显示,MiERF113基因在果皮和果肉中均有表达,且随着果实不断成熟其表达量在逐渐增加,在采后贮藏12 d时表达量达到最高。本研究为揭示MiERF113基因在芒果采后成熟过程中的调控作用提供理论依据。     

芒果MiFY基因克隆和表达模式分析

FY是拟南芥自主途径中调控成花的基因,FY通过与RNA结合蛋白FLOWERING CONTROL LOCUS A (FCA)相互作用下调成花抑制基因FLOWERING LOUS C (FLC)的表达从而促进开花。目前关于FY基因如何调控芒果成花的机制尚无研究报道。通过挖掘芒果转录组数据克隆获得1个FY基因,命名为MiFY。生物信息学分析显示,MiFY基因的ORF全长为2178 bp,编码725个氨基酸,蛋白质分子量为799.59 kDa,理论等电点为8.72,氨基酸序列中含有WD40和Cytadhesin_P30两个保守结构域。基因表达模式分析显示,MiFY基因在2个芒果品种的开花期均具有较高的表达水平,而在营养生长期表达水平较低。因此推测MiFY基因可能在调节芒果成花中起着重要作用。     

巴西橡胶树生长素响应HbJAR1基因克隆与表达分析

JAR1基因是植物生长素响应基因,具有维持植物体内生长素浓度动态平衡和增强植物抗逆性的功能。为了阐明巴西橡胶树中JAR1基因的结构与功能,本研究利用Q-PCR技术在橡胶树CATAS7-33-97叶片中扩增了JAR1基因,其推导氨基酸含有JAR1蛋白特征性的GH3 superfamily结构域,无信号肽,无跨膜区域,定位在细胞质中,命名为HbJAR1。表达分析结果表明:该基因在橡胶树叶片中的表达量受光照强度、机械伤害和白粉菌侵染显著上调,吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、乙烯利(ET)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)对HbJAR1在橡胶树中的表达也起到不同程度的上调作用。表明HbJAR1基因属于植物JAR1家族,与橡胶树对光照、伤害等逆境响应有关。     

花生中促丝裂原蛋白活化激酶6a(AhMAPK6a)的克隆与表达分析

促丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)是一类保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,是一类植物对逆境胁迫反应途径中的关键家族基因。本研究利用已经构建的花生种子全长cDNA文库,以拟南芥MAPK序列为模板,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了一个MAPK基因,命名为AhMAPK6a,并在GenBank上注册,注册号为KP329549。其cDNA序列全长1492bp,开放阅读框(ORF)含有1191bp,编码一条含有397个氨基酸的蛋白序列。不同物种中MAPK基因的氨基酸序列比对发现,该基因含有典型的Ser/Thr保守基序,与拟南芥、大豆、本生烟的同源性分别为86%、94%和90%。不同组织部位的荧光定量(qPCR)分析表明,该基因在叶片中的表达量最高,其次在根中,在茎、花、子叶和下胚轴中的表达量极低,表明该基因可能在花生的根和叶的生长发育中发挥较大作用。在脱落酸(ABA)和聚乙二醇(PEG)胁迫下,表达量发生明显变化,可以推测该基因在干旱胁迫反应中发挥重要作用。     

芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族,与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中,从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因,分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示,MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp,2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp,编码244个氨基酸,蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示,2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点,但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示,2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低,但在成花转变后期的芽中持续上调表达,在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。     

巴西橡胶树中2个NADP-苹果酸酶基因的克隆和表达特性分析

从橡胶树中克隆2个NADP-ME(苹果酸酶)基因的全长cDNA,分别命名为HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全长分别为2 428、2 139 bp,分别编码643、593个氨基酸组成的蛋白,二者的氨基酸序列一致性高达87.25%,且分别与蓖麻和杨树的一个NADP-ME序列具有较高的序列一致性。2个HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守结构域,均富含亮氨酸(Leu),同属于非分泌型稳定蛋白。2个HbNADP-ME基因在橡胶树不同组织中的表达存在明显差异,在根中的表达量最高,种子和花中的表达量次之;另外,HbNADP-ME1基因在胶乳中受机械伤害有下调表达趋势,HbNADP-ME2基因在胶乳中受割胶处理也表现出下调表达趋势,而低温胁迫则显著诱导2个基因在叶片和根中的表达。结果说明,HbNADP-ME基因可能参与橡胶树的抗逆应答及代谢调控(包括胶乳代谢调控)。此结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定了基础。     

小麦 TaCSL1基因的克隆及表达模式分析

Clavaminate Synthase-Like（CSL）是生物体内的一种氧化还原酶,可催化氨基酸羟基化。为初步了解小麦CSL基因并探究其相关生物学功能,利用同源克隆的方法,以拟南芥 At3g21360（GenBank Accession：NC_003074.8）基因CDS序列为探针搜索小麦基因组核酸序列数据库,得到小麦A、B、D三个亚基因组上的部分同源基因序列。对上述三条序列的全长与编码区进行克隆和测序,经生物信息学分析,发现这三个基因编码的蛋白属于CSL家族。命名该基因为 TaCSL1,来自A、B、D三个亚基因组的部分同源基因分别命名为 TaCSL1-3A、 TaCSL1-3B、 TaCSL1-3D。实时荧光定量PCR分析表明,这三个部分同源基因在小麦不同生长发育阶段和不同组织部位均有表达,除叶鞘组织外,其相对表达水平在各时期叶片中均高于其他组织。分析该基因在小麦不同生长发育时期叶片的相对表达水平发现,该基因的相对表达量在幼苗期至孕穗期持续提高,抽穗期显著下降,开花后再次提高,生育末期降低。就三个部分同源基因的表达水平而言, TaCSL1-3A相对表达量均较低,而 TaCSL1-3B的相对表达量在孕穗期之前最高, TaCSL1-3D在孕穗期之后最高。本研究明确了 TaCSL1的时空表达特征,可为深入研究小麦氨基酸羟基化过程和植物抗病机理研究提供新思路。     

巨桉EgrWOX5基因的克隆、表达分析与超表达载体构建

以巨桉(Eucalyptus grandis)EG5无性系为试验材料,通过RT-PCR技术从中克隆得到了1个巨桉WOX家族基因成员的CDS序列,命名为Egr WOX5(Gen Bank登录号为KF964019)。该基因全长为543 bp,编码181个氨基酸,具有WOX基因家族最保守的特征结构域-Homeobox domain(HD)结构域;其氨基酸序列与草本植物的拟南芥At WOX5基因和木本植物杨树Ptr WOX5基因的氨基酸序列有较高的相似性。组织表达分析结果显示,Egr WOX5基因特异性地在巨桉EG5的根组织中表达。这些结果间接或直接地说明Egr WOX5在巨桉根组织的发育过程中发挥重要作用。本研究还利用Gateway技术成功构建了Egr WOX5基因的超表达载体,为后续基因功能的进一步鉴定奠定基础。     

小麦TaGeBPL基因的克隆及表达分析

无表皮毛增强子结合蛋白GeBP(GLABROUS1 enhancer-binding protein)是植物体内特有的一类转录因子,可调控植物表皮毛的生长过程,在植物生长发育、衰老、抗逆、防御反应进程中发挥着重要作用。前期对自发斑点细胞坏死RILs(N13039H/N)进行转录组学比较,发现一个未知功能基因在两个材料中表达差异显著。为深入了解小麦中该基因的序列特征和表达特性,通过RT-PCR方法克隆获得了CDS区域片段。生物信息学分析结果表明,该基因位于3D染色体上,CDS编码区长度为1 527 bp,共编码508个氨基酸,含有1个DUF573结构域和3个核定位信号。InterPro比对表明,编码蛋白属于GeBP家族,故将该基因命名为TaGeBPL。亚细胞定位结果表明,TaGeBPL定位于细胞核。白粉病菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染条件下的定量qRT-PCR结果表明,TaGeBPL基因在感白粉病近等基因系N9134S中的表达模式呈双峰曲线变化,侵染12和36 h时,基因表达显著上调,而在抗白粉病近等基因系N9134R中的表达呈单峰曲线变化,在侵染12 h时显著下调。TaGeBPL在N9134S中的相对表达量始终高于在N9134R中的表达量,由此推测TaGeBPL基因可能参与病原菌响应的相关途径。酵母转录激活试验表明,TaGeBPL转录因子没有转录自激活活性。本研究结果为深入解析GeBP的功能奠定了基础。     

芒果中性/碱性转化酶MiNI基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术克隆了1个编码NI基因的cDNA序列,命名为MiNI基因,并对不同来源的中性/碱性转化酶的分子特征及系统进化进行比较分析。结果表明：MiNI基因开放阅读框为2034 bp,编码677个氨基酸,相对分子量为76.6 kDa,理论等电点为6.24;生物信息学分析结果显示,NI二级结构α螺旋占38.85%,无规则卷曲占35.45%,伸展链占18.91%,β折叠占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100结构保守域,与克里曼丁桔、龙眼、巴西橡胶树和番木瓜都具有一致的motif位点;MiNI基因编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、龙眼氨基酸序列同源性最高;构建NI系统进化树分析表明,与芒果遗传距离最近的是克里曼丁桔,最远的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析显示,果皮MiNI基因表达量远高于果肉;花后10~40 d,果皮MiNI基因表达量显著下降;花后40~100 d,果皮MiNI基因表达量维持在一个相对稳定水平;花后100~130 d,随着果实成熟,果皮MiNI基因表达量又显著上升;而花后10~40 d,果肉MiNI基因表达量显著下降,至果实发育后期果肉MiNI基因表达量始终处于极低水平。该研究为进一步了解MiNI基因在芒果果实蔗糖代谢过程中的作用以及从分子角度阐明芒果糖代谢机理奠定理论和技术基础。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

橡胶树类萌发素蛋白基因HbGLP01的克隆及其表达分析

类萌发素蛋白(GLPs)是一类重要的胁迫响应蛋白,参与植物的多种生理调控过程。试验前期通过cDNA-AFLP技术,从橡胶树转录组中筛选到一个与麻风树JcGLP(XM_012225699.1)高度同源的差异表达片段。在此基础上,通过基因预测和PCR扩增克隆到一个GLPs类基因HbGLP01。该基因包含2个外显子和1个内含子,cDNA全长696nt,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为24.8ku和5.54。同源比对表明,该蛋白与麻风树JcGLP1-13蛋白的同源性最高,达到81%。聚类分析研究表明,该蛋白与JcGLP1-13、胡杨PeGLP1-13及三角叶杨PtGLP等聚为一个分支。qRT-PCR分析发现,多主棒孢病菌侵染能诱导橡胶树HbGLP01基因的上调表达,其中高抗棒孢霉落叶病品种IAN873在侵染后24h时表达量达到峰值,高感品种PR107在48h后达到峰值,而且在IAN873中的表达峰值显著高于PR107。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

二穗短柄草2C型蛋白磷酸基因BdPP2C1的克隆及表达分析

从二穗短柄草中扩增得到一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C1。BdPP2C1与拟南芥中PP2C家族进行系统进化分析,结果表明,BdPP2C1与拟南芥A类PP2C家族成员的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR表达分析系统,分析在非生物逆境胁迫及相关信号分子处理下BdPP2C1基因的表达情况。结果表明:该基因的表达受脱落酸(ABA)和双氧水抑制,并且受渗透和低温胁迫诱导。因此,BdPP2C1是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。