鲤鱼抗寒性状的 RAPD分析

鲤鱼抗寒性状的ＲＡＰＤ分析ＲＡＰＤＡＮＡＬＹＳＩＳＦＯＲＴＨＥＣＨＡＲＡＣＴＥＲＯＦＣＯＬＤ－ＴＯＬＥＲＡＮＣＥＯＦＴＨＥＣＯＭＭＯＮＣＡＲＰ梁利群孙孝文沈俊宝闫学春（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨１５００７０）ＬｉａｎｇＬｉｑｕｎＳｕｎ...     

采用RAPD技术筛选马口鱼性别差异相关分子标记

选用SBSA和SBSB两组随机引物（各20条）分别对马口鱼卵巢DNA和精巢DNA进行RAPD扩增,并用1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果表明,在40条随机引物中,有11条引物可以扩增出明显的雌雄性别差异条带,条带范围以SBSA5、SBSA6、SBSA9、SBSA16、SBSA19、SBSA20、SBSB2、SBSB3、SBSB9、SBSB16、SBSB17为主。运用RAPD筛选获得马口鱼性别DNA标记将有助于了解其调控雌雄性别发生的差异基因,为进一步的遗传育种提供基础。     

斑马鱼微卫星分子标记检测鲤鱼种间多态性

用6072对斑马鱼（Danio rerio）微卫星引物对黑龙江鲤（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）、荷包红鲤（Cyprinus carpio var．wuyuanensis）和柏氏鲤（Cyprinus pellegrini Tchang）进行种间遗传差异分析，共发现563个斑马鱼微卫星标记在鲤鱼种间表现出多态性。从中随机抽选25个标记，对斑马伍和3种鲤鱼的遗传多样性进行分析，使用Phylip3．63软件按照Nei氏标准遗传距离计算种间遗传距离，再用MEGA3．0软件绘制NJ系统发生树，并进行1000次bootstrap检验系统树。结果显示，黑龙江鲤与荷包红鲤首先聚类，然后是柏氏鲤、斑马鱼。这些具有多态性的斑马鱼微卫星标记可用于鲤鱼种间种质鉴定，同时，借用模式生物斑马鱼的丰富遗传标记资源，增加同科的鲤鱼遗传连锁图谱上遗传标记的密度，必将对鲤鱼遗传育种进入分子育种时代起到促进作用。     

鳙鱼微卫星分子标记的筛选

采用常规方法从鳙鱼(Aristichthys nobilis)血液中提取基因组DNA,经限制性内切酶Sau3AI酶切后,选取250～750bp大小的片段构建鳙鱼基因组文库。采用人工合成的重复序列(CA)15、(AG)12、(AAG)8用同位素标记作为探针,通过原位杂交筛选基因组文库,获得鳙鱼的微卫星序列。进一步用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物。通过杂交获得99个阳性克隆,经测序筛选出82个微卫星序列,设计引物65对。     

澳洲鳗鲡微卫星分子标记的筛选与检测

采用小片段克隆法构建了澳洲鳗鲡(Anguilla australis)的部分基因组文库,并用地高辛标记的(CA)15作探针筛选阳性克隆,共获得76条微卫星序列.其中10次以下CA连续重复序列占83.67%,没有检测到30次以上的连续重复序列.根据微卫星序列两端足够长的侧翼序列,设计引物55对,选择合成引物26对,用澳洲鳗鲡3个个体的混合基因组进行引物筛选,其中的18对具有清晰的扩增条带.将筛选出的18对引物对澳洲鳗鲡1个群体的40个个体进行了遗传多样性分析,其中1对引物扩增产物为单态,17对扩增产物呈现多态;17对扩增多态的引物在40个个体中扩增出等位基因数目为5～14,平均为9个.该澳洲鳗鲡群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.715 7、0.677 9、0.7374,所有位点均符合哈迪-温伯格平衡(P=0.05),结果证明这17个微卫星位点适于澳洲鳗鲡群体结构的研究分析.[中国水产科学,2009,16(1):133-138]     

镜鲤体重相关分子标记与优良子代的筛选和培育

根据性状相关分子标记的QTL分析结果进行品种培育是分子标记用于水产育种研究的重要方向之一。本研究利用镜鲤与体重相关的3个基因座(HLJ302、HLJ338、HLJ343)作为快速生长的标记,筛选出一批镜鲤亲本进行繁殖,对得到的子代进行基因分型,并将基因分型结果与检测的最大10尾个体与最小10尾个体进行比较,结果表明最大10尾具有优势基因型为每尾1.7个,最小10尾具有优势基因型为每尾0.7个,生长速度快群体与生长速度慢群体在体重相关基因型的富集上呈现显著性差异。同时选出具有富集体重相关优势基因型的子代且生长速度快的群体一个,2008年生产出子二代。综合性状好生长速度更快的镜鲤新品系正在培育之中。     

鲤鱼的遗传连锁图谱（初报）

建立了鲤鱼的遗传连锁图谱。图谱有ＲＡＰＤ分子标记５６个,鲤鱼的ＳＳＬＰ标记２６个,鲤鱼ＳＳＬＰ标记１９个,斑马鱼的ＳＳＬＰ分子标记７０个,鲤鱼基因标记９１个,共有标记２６２个;图谱有５０个连锁组,连锁图给出鲤鱼的基因组大小在５７８９ＣＭ左右。     

瓦氏雅罗鱼耐碱性状相关分子标记的筛选

本研究以来自达里湖(碱水)和松花江(淡水)的瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)杂交F2为实验材料,通过碱度耐受实验进行性状测定,以39对多态的EST-SSR和SSR为标记,对77个F2个体进行基因分型,根据Fisher确切概率法对F2基因型和耐碱性状进行关联分析。结果发现,有2个标记与耐碱性状显著相关(P0.05),其中1个标记为EST-SSR,从瓦氏雅罗鱼转录组数据库中调取该EST序列,基因注释结果显示该序列与团头鲂(Megalobrama amblycephala)低氧诱导因子HIF-3?基因、草鱼的低氧诱导因子HIF-4?基因具有很高的同源性。该基因的主要功能是参与鱼类的耐低氧反应过程,加强鱼类的耐低氧能力。本研究对于今后深入研究此功能基因的作用机制及培育适于盐碱水域养殖的鱼类新品种具有重要的意义。     

建鲤与兴国红鲤RAPD分子标记的研究

利用随机扩增多态DNA(RAPD) 技术对鲤鱼的两个品系, 即建鲤和兴国红鲤进行了遗传分析。在所用20 个10 碱基随机引物扩增产物中, 找到了建鲤与兴国红鲤品系间的RAPD分子遗传标记, 为鲤鱼主要品系的保存和保护以及品种的选育工作提供了一种新的技术手段和基础资料。     

中国对虾生长性状相关遗传标记的筛选与克隆

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对中国对虾“黄海1号”快速生长的第6代群体同一养殖池中生长性状发生分离的两个极端群体、海捕的中国对虾对照群体,进行生长相关遗传标记的筛选。采用240个RAPD引物,共产生标记数2156个。筛选出与生长性状相关的遗传标记65个,其中正相关标记55个,负相关标记10个。依据这些标记在群体中出现的频率和变化规律,筛选出9个特异性标记,其中正相关标记7个,负相关标记两个。对这些特异性标记进行序列测定,获得了6个完整的DNA序列(Genebank注册号DQ185932-DQ185937),并将测序结果进行BLAST分析,发现测得DNA的序列与数据库中已注册序列的相似性较低,未能找到同源性较高的功能基因。根据每一序列重新设计引物,已有两个RAPD标记成功转化为稳定的SCAR标记。     

应用RAPD和SCAR复合分子标志鉴定东北黄颡鱼

采用17个随机引物和3对特异性引物,测定了东北三省黄颡鱼主要分布区的RAPD和SCAR图谱。根据RAPD电泳结果鉴定,所检测的48尾鱼分属于3种黄颡鱼,经SCAR复合分子标志确定,分别是普通黄颡鱼(Pelteobagrus eupogon)、瓦氏黄颡鱼(P.vachelli)、光泽黄颡鱼(P.nitidus)。     

青海湖裸鲤与鲤、鲫、草鱼的随机扩增多态DNA分析

本文利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对4 种鲤科鱼类,即裂腹鱼亚科的青海湖裸鲤、鲤亚科的鲤和鲫鱼、雅罗鱼亚科的草鱼基因组DN A进行了分析,目的是探讨青海湖裸鲤的系统分类位置.遗传距离指数计算结果显示,鲤亚科2个鱼种间的相似性显著高于青海湖裸鲤和草鱼间的相似性,而裂腹鱼亚科的青海湖裸鲤与另两个鲤亚科三种鱼类之间的差异(0.8769、0.7145、0.6930)明显高于雅罗鱼亚科草鱼与鲤亚科鲤、鲫鱼之间的差异(0.4718、0.5218).在此基础上讨论了RAPD技术适用性的一些问题.     

用RAPD方法研究草鱼、柏氏鲤和3个地理种群鲤的亲缘关系

用２４种随机引物对雅罗鱼亚科（Ｌｅｕｃｉｓｃｉｎａｅ）的草鱼,鲤亚科（Ｃｙｐｒｉｎｉｎａｅ）的柏氏鲤和３个地理种群鲤（荷包红鲤、黑龙江野鲤和德国镜鲤）进行ＲＡＰＤ分析,构建了这５种鱼类的基因组指纹图谱。通过对获得的基因组指纹图谱的量化分析,利用ＵＰＧＭＡ重建了它们之间的亲缘关系。结果鲤种内３个地理种群之间的相似性高于鲤和柏氏鲤种间的相似性,而草鱼与另４种鲤亚科鱼类亚科之间的差异明显高于柏氏鲤、黑龙     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的RAPD分析

在优化RAPD检测条件的基础上，从100个随机引物中筛选出60个扩增较好的引物对异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和湘江野鲤相互间扩增DNA片段的异同性进行比较研究。结果显示，60个引物共产生1554条带，单一引物扩增的DNA片段数在6～20条之间，片段大小在200～3500bp之间。遗传相似率分析表明，异源四倍体鲫鲤与其原始母本红鲫的相似率为69．41％，与其原始父本野鲤的相似率为64．47％，说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本红鲫的遗传物质要多一些；而红鲫和野鲤之间的相似率为42．18％，说明两者的基因组成有较大的相似性，从分子水平证实了红鲫和野鲤的远缘杂交具有较大的亲和性。在分析中，还发现异源四倍体鲫鲤有4条非亲本带，非亲本带谱率达0．72％，这些非亲本带可以作为异源四倍体鲫鲤特异性的分子标记。     

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。     

不同鲤鱼种间DNA遗传标记多态性

用８４个随机引物对黑龙江野鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ ｈａｅｍａｔｏｐｔｅｒｕｓ Ｔｅｍｍｉｎｃｋ ｅｔ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）和柏氏鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ Ｔｃｈａｎｇ）进行种间ＲＡＰＤ分析,结果共扩增出４８４个片段,二者共有扩增片段为１３个,黑龙江野鲤特有的为２３３个,柏氏鲤特有的为２２５个,这些特异片段可做为黑龙江野鲁和柏氏鲤的分子遗传标记。并对     

Genetic diversity in common carp stocks assayed by random-amplified polymorphic DNA markers

The common carp (Cyprinus carpio L.) is one of the major aquaculture species, contributing nearly 35% to the inland fish production in Karnataka, India. Stocks collected from Hungary (2), Indonesia and Vietnam were assessed alongside two local stocks in a series of culture performance trials with the objective of setting up a base population for developing a breeding programme. The present study deals with the genetic divergence and polymorphism in these six stocks using random‐amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. A total of 180 decamer random primers were screened for polymerase chain reaction (PCR) amplification (OPA 1‐20, OPB1‐20, OPC1‐20, OPD1‐20, OPE1‐20, OPF1‐20, OPG1‐20, OPP1‐20 and OPM1‐20). Eight primers were selected for analysis of common carp genotypes (OPA‐7, OPA‐20, OPB‐17, OPF‐10, OP F‐9, OPG‐4, OPG‐9 and OPP‐16). Out of 492 bands recorded, 57.1% were polymorphic. Stepwise regression analysis was carried out to find best combination markers affecting body weight (P<0.001). The results demonstrate major differences in the genetic structures between different stocks. Dendrogram data showed grouping of individuals according to stocks and corresponding data variables revealed the per cent homology within the stock and also found markers correlating to the body weight.     

用RAPD技术鉴定荷包红鲤抗寒品系

本利用RAPD技术对荷包红鲤抗寒品系的基因组DNA进行分析。通过对50个引物,150次的RAPD分析,找出了用RAPD技术从分子生物学角度对荷包红鲤抗寒品系进行鉴定的方法。     

鲤WISP基因家族的克隆、表达及系统进化树的构建

Wnt1诱导分泌蛋白(WISP)基因家族与CYR61、CTGF、NOV基因共同构成了CCN家族。研究通过鲤基因组序列与斑马鱼WISP基因编码区全序列的比对获得WISP1a、WISP1b、WISP2、和WISP3等4条序列。经过克隆、测序、比对拼接得到其开放阅读框,分别是1 089、1 077、1 038和1 026 bp,它们都是由5个外显子和4个内含子构成,分别编码362、358、345和341个氨基酸。分子系统学分析表明,鲤4个WISP基因具有高度同源性,其中WISP1a、WISP1b和WISP2均含有4个模块,WISP3缺少第2个模块。通过RT-PCR检测WISP基因在鲤组织中的表达,结果表明,WISP1a鲤在13个组织中均有表达,皮肤中表达最高,脾、肠、卵巢次之,其他组织中表达较低。WISP1b在精巢、脑、皮肤、卵巢中表达较高。WISP2在血液、鳃中表达较高。WISP3在血液、脑、肝中表达较高。实时荧光定量PCR法分析WISP基因在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明,除WISP3外,WISP1a、WISP1b和WISP2在前期表达较高,36 h表达最低,随后逐渐升高至第6天开始下降。