一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的耐药性及耐药基因分析

对一株分离自大黄鱼的致病性溶藻弧菌进行耐药性分析,分别用纸片扩散法、倍比稀释法检测了该菌对磺胺甲噁唑、氟苯尼考、盐酸多西环素、红霉素、盐酸环丙沙星、土霉素、恩诺沙星、硫酸新霉素、氨苄西林钠共9种药物的耐药性,同时用PCR法检测了该菌β-内酰胺酶基因bla CTX-M,喹诺酮类耐药基因(qnrVC,qnrVC5),四环素耐药基因(tetS、tetM)等耐药基因的携带情况。结果表明该菌对氨苄西林钠等药物耐药。对氟苯尼考、磺胺甲噁唑高度敏感。同时该菌携带bla CTX-M,qnrVC 2种耐药基因。本研究的结果为溶藻弧菌病的精准用药提供了数据支持。     

诺氟沙星对溶藻弧菌和恩诺沙星对迟缓爱德华菌的抗生素后效应

采用试管二倍稀释法测定诺氟沙星对溶藻弧菌s6 2 2、恩诺沙星对迟缓爱德华菌 75 1的最小抑菌浓度(MIC) ;采用菌落计数法测定诺氟沙星对溶藻弧菌、恩诺沙星对迟缓爱德华菌的抗生素后效应 (PAE)。结果显示 ,诺氟沙星对溶藻弧菌s6 2 2在 1/2MIC、1MIC、2MIC和 4MIC浓度时的PAE分别为 :0 .4 7h、0 .76h、1.2 6h和2 .0 5h ;恩诺沙星对迟缓爱德华菌 75 1在 1/2MIC、1MIC、2MIC和 4MIC浓度时的PAE分别为 :0 .2 9h ,0 .4 8h ,1.97h ,2 .30h。结果表明 ,诺氟沙星和恩诺沙星具有明显的PAE ;该结果提示 ,在制定给药方案时可以适当延长给药间隔时间 ,减少给药次数 ,仍能维持抗菌效果。     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

一株致病性溶藻弧菌的多重耐药与毒力基因分子分析

从发病的凡纳滨对虾中分离并经鉴定得到一株溶藻弧菌(命名为:V_A-76),通过对虾回感实验和药物敏感性实验分别对V_A-76菌株的耐药表型和致病能力进行了研究,并运用PCR方法检测了该菌的毒力相关基因、整合子和耐药基因的携带情况。对虾感染实验结果表明,溶藻弧菌V_A-76能够导致凡纳滨对虾发病死亡。经PCR检测发现,该菌携带8种毒力相关基因:tdh、tlh、tox S、collagenase、fla A、omp W、asp A和fur。药敏结果显示,V_A-76对环丙沙星、氯霉素、链霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、复方新诺明和利福平7种药物表现出较高的耐药水平,且该菌包含1类整合子、4类超级整合子SXT和1型插入序列共同区(ISCR1)。此外,该菌携带arr-2、dfr A27、str A、str B、floR、cat和qnrv C耐药相关基因。从上述研究结果可知,菌株V_A-76既具有一定的感染能力,同时对多种抗菌药物表现出较高的耐药水平,提示应对养殖源致病性弧菌的耐药性现状予以更多的关注。     

斜带石斑鱼溶藻弧菌病的研究

从患病的斜带石斑鱼肝和肾组织分离的两株病原菌,进行纯化培养、人工感染、VITEK-AMS-32自动微生物分析鉴定及药敏试验,经形态和生理生化测定,确定为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。组织病理变化主要表现为鳃、肝和肾细胞变性、坏死,病变组织炎性细胞浸润,呈变质性炎症。     

梭子蟹溶藻弧菌病的初步研究

2005～2006年,昌邑池塘养殖梭子蟹发生被称为"牙膏病"的疾病,并导致大量死亡。发病时间主要在7～9月份的高水温期,病蟹典型症状是肌肉白浊、无弹性、呈不透明的乳白色。从病蟹的肌肉、肠道、胃、眼球、肝胰腺均分离到单一形态的微生物,经生理生化鉴定为溶藻弧菌。人工感染实验发现,其对健康梭子蟹具有致病性,出现与自然发病蟹相同的症状,并在人工感染病蟹中分离出同样性状的菌株,证实其为该病病原菌。     

溶藻弧菌引起虾病暴发的病原学研究

<正> 副溶血弧菌 Vibrio Parahaemolyticus和溶藻弧菌 V.alginolyticus 均能引起食物中毒、创伤感染和败血症等,引起对虾致病也曾有报道。但对弧菌的生物学特性作系统研究的资料在水产方面的杂志上还很少报道。1990年5月28日,位于象山港末端大佳何高湖塘养殖场的5号、24号塘内的对虾突然发病,103亩虾塘内110万尾对虾毁于旦夕,同时在其他塘内也发现了同样的疾病。作者于5月30日应邀去现场进行残活病虾的检验,发现肝脏发白或呈棕灰色,肌     

致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法研究静置培养条件下致病性溶藻弧菌ND-01在酶标板上成膜情况。结果显示,溶藻弧菌的生物膜的OD590在16h达到峰值后,随培养时间延长出现下降;在102～108cfu/mL范围内,不同的初始菌密度对生物膜的OD590影响并不显著;NaCl质量分数为4.5%时,所形成生物膜的OD590最高;30℃,溶藻弧菌的生物膜OD590显著高于其他温度组(P0.05);在胰蛋白胨大豆肉汤培养液中加入质量分数1.5%的CaCl2,能够显著促进生物膜形成,而加入MgCl2对于生物膜的影响则不显著;经过大黄鱼表皮黏液包被后,96孔板中生物膜的OD590显著高于其他部位组织提取液包被组(P0.01)。致病性溶藻弧菌ND-01能够在聚苯乙烯材料的96孔酶标板表面形成稳定而明显的生物膜,且其生物膜的形成与多种环境因素有着密切关系。     

鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果

将鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）分别用0.3%福尔马林灭活,制备成鳗弧菌和溶藻弧菌2种单苗,并将2种菌等量配制成二联疫苗,单次腹腔注射免疫大菱鲆（Scophtalmus maximus）.通过检测免疫后替代途径补体活力、溶菌酶活力、抗体凝集效价的变化并分别进行攻毒实验比较疫苗的免疫效果.结果显示,3种疫苗对所测定的各免疫指标都有一定的促进作用,但二联疫苗后期效果低于2种单苗.二联疫苗对鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为83.52%和83.24%,而鳗弧菌单苗对鳗弧菌攻毒、溶藻弧菌单苗对溶藻弧菌攻毒的免疫保护率分别为80.37%和74.89%.可以认为2株菌具有制备二联疫苗的可能性.[中国水产科学,2006,13（3）：397-402]     

不同毒力溶藻弧菌脂多糖的多态性研究

提取了10株不同毒力的溶藻弧菌脂多糖,其中HN08811、HN08155、HN08813、HN08335、HN07006为毒力菌株,HN08805、HN08307、HN08156、HN08801和TG06003为非毒力菌株.分别取10μg进行SDS-PAGE电泳.结果表明,不同毒力溶藻孤菌脂多糖的电泳条带存在较丰富的多态性,在类脂质A区段(分离胶的上半部分),不同菌株间图谱呈片状堆积,多态性难以分辨;在抗原多糖O-特异性侧链条带区段(分离胶的下半部分),除HN07006外,毒力菌株的条带清晰,数目在7～9条之间,所有非毒力菌株产生细而密集的可辨条带.本文为一类遗传型的溶藻弧菌毒力菌株的快速鉴别提供了一种新的分子分型指标,也为溶藻弧菌的血清型分型提供了直接理论依据.     

海南地区溶藻弧菌耐药性及其质粒多样性的研究

调查了海南省的30株溶藻弧菌环境菌株对24种常见抗生素的耐药性,并对菌株携带质粒及其多样性进行了研究,所有菌株对洁霉素、乙酰螺旋霉素、万古霉素、氯洁霉素、制霉菌素5种抗生素完全耐药,对24种抗生素的耐药率为20.8%～66.7%,表明该地区溶藻弧菌具有严重的多重耐药性;30株溶藻弧菌中有22株不携带质粒,8株携带1～3个质粒,质粒为1.20～12.5kb;8株携带质粒的菌株共形成了7种类型的质粒指纹图谱。试验结果表明,该地区溶藻弧菌的耐药性与其是否携带质粒无明显关系。分离菌株的耐药性可能主要是由染色体相关基因引起的。     

复方中草药及其与抗生素联用对斜带石斑鱼溶藻弧菌病的治疗效果

通过药物体外抑菌效果及对斜带石斑鱼抗病力影响的研究,筛选有效治疗斜带石斑鱼溶藻弧菌病复方中草药与中西药联用配方。用诃子、白芍、甘草比例分别为0.9∶1.3∶0.9、1.2∶0.9∶1.0和1∶1∶1的复方中草药对溶藻弧菌进行体外抑菌实验;将质量分数为2.2%的复方中草药与中西药联用添加到基础饲料中设为实验组,研究中西药对斜带石斑鱼溶藻弧菌病治疗效果。复方中草药实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为投喂饲料中添加不同比例诃子、白芍、甘草,中西药联用实验组Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分别为投喂饲料中添加不同比例诃子、白芍、甘草、恩诺沙星。结果显示,复方中草药配方二药物质量浓度200 mg/mL,为最佳配方。40 d病鱼死亡数量比较结果为对照组Ⅱ对照组Ⅳ对照组Ⅲ实验组Ⅲ实验组Ⅱ实验组Ⅰ实验组Ⅴ实验组Ⅵ实验组Ⅳ对照组Ⅰ。实验组Ⅰ投喂饲料加诃子、白芍、甘草比例为0.9∶1.3∶0.9的复方中草药,实验组Ⅳ配方为诃子、白芍、甘草、恩诺沙星比例为0.9∶1.3∶0.9∶1.3,分别为治疗斜带石斑鱼溶藻弧菌病效果最好的复方中草药和中西药联用配方。研究表明,中西药联用复方药效强于复方中草药,均能较好治疗斜带石斑鱼溶藻弧菌病。     

诺氟沙星对溶藻弧茵和恩诺沙星对迟缓爱德华菌的抗生素后效应

采用试管二倍稀释法测定诺氟沙星对溶藻弧菌s622、恩诺沙星对迟缓爱德华菌751的最小抑菌浓度(MIC)；采用菌落计数法测定诺氟沙星对溶藻弧菌、恩诺沙星对迟缓爱德华菌的抗生素后效应(PAE)。结果显示，诺氟沙星对溶藻弧菌s622在1／2MIC、1MIC、2MIC和4MIC浓度时的PAE分别为：0．47h、0．76h、1．26h和2．05h；恩诺沙星对迟缓爱德华菌751在1／2MIC、1MIC、2MIC和4MIC浓度时的PAE分别为：0．29h，0．48h，1．97h，2．30h。结果表明，诺氟沙星和恩诺沙星具有明显的PAE；该结果提示，在制定给药方案时可以适当延长给药间隔时间，减少给药次数，仍能维持抗菌效果。     

溶藻弧菌单克隆抗体的制备及应用

小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0与经溶藻弧菌(1.1587)免疫的BALB3/C雌鼠脾细胞在PEG条件下融合,有45.8%的培养孔有杂交瘤细胞生长,其培养上清液抗体阳性率为77.4%.经反复有限稀释法克隆杂交瘤细胞,获得7株抗溶藻弧菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为AC1-C9,AC1-C11,BB4-D4,AD1-A3,AD1-F3,AD2-E7,AD2-F7.取AD1-F3扩大培养,注射小鼠,制备了抗溶藻弧菌的单克隆抗体腹水,滴度为11000.该腹水与其他3株溶藻弧菌菌株有强交叉反应,与其他13株标准菌株无交叉反应.利用制备的单抗腹水,建立了检测溶藻弧菌的单抗-ELISA技术.该反应系统可应用于溶藻弧菌的快速诊断,反应时间为6-7h,检测灵敏度为104cells·-1.并利用该检测方法进行了11份待测菌样本溶藻弧菌的检测.     

哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗的效果研究

采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS).通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联.OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳鲹(Trachinotus cvatus).检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳鲹经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单混合物免疫后,各免疫组间血清溶菌酶活性没有显著差异(P＞0.05),但均显著高于生理盐水对照组(P＜0.05);OMPC-LPS偶联物免疫组的血清抗溶藻弧菌EpGS021001抗体效价较单纯溶藻弧菌LPS免疫组、简单混合物免疫组出现得早,抗体滴度高;与此类似,OMPC-LPS偶联组中抗哈氏弧菌SpGY020601的血清抗体效价较单纯哈氏弧菌OMPC组、简单混合组出现得早,抗体滴度高,且持续时间长;对EpGS021001、SpGY020601的攻击,OMPC-LPS偶联物免疫组的保护率分别为85%和95%,高于单纯溶藻弧菌LPS免疫组的70%、单纯哈氏弧菌OMPC免疫组的75%,也高于简单混合物免疫组的80%和82.5%.     

抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联卵黄抗体的制备及体外抑菌效果的研究

为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对三种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1:51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。综上所述,本研究制备的三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。     

应用RD-PCR技术构建溶藻弧菌的cDNA文库

应用限制性显示PCR(RD-PCR)技术构建溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进行测序,根据测序结果进行生物信息学分析和结果验证。实验结果表明,我们成功地构建了溶藻弧菌poly (A)化mRNA的cDNA文库,获得一百多个基因片段并对其中53个基因片段进行测序分析,获得了如细菌Ⅲ型分泌系统易位蛋白、趋药性传感器、类丝氨酸蛋白酶等毒力相关因子的基因片断。并且在一定程度上证实了poly(A)化在细菌中不是个别和偶然的现象。实验结果说明了我们所构建的溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库质量高,文库基因片段的重复性低,筛选基因片段效率高、目的性强。本文并探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA的cDNA1文库构建中的应用价值。     

杂色蛤病原菌—溶藻弧菌的分离与回接感染试验

1991年7月下旬至10月上旬,辽宁东沟县沿海出现杂色蛤大批死亡,从病杂色蛤体内分离到病原菌,经人工感染试验得到证实。病原菌为革兰氏阴性短杆菌,以极生单鞭毛运动,在TCBS琼脂平板上形成黄色大菌落,在固体培养基上能游动。发酵葡萄糖产酸不产气,精氨酸—碱反应阴性,赖氨酸、鸟氨酸脱羧阳性,对弧菌抑制剂0/129(150μg)敏感,被鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。通过回接试验证明此溶藻弧菌使杂色蛤死亡。     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护试验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110～150g的大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1&#215;109cfu/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示,第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护实验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110~150g大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109CFU/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示:第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。