矮牵牛B-box型锌指蛋白基因PhBBX8的克隆与表达分析

利用矮牵牛（Petunia hybrida）基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的相关基因,从中发现1个B-box型锌指蛋白基因PhBBX8。通过RT-PCR克隆得到该基因的编码区序列（CDS）,为1 242 bp,预测其编码氨基酸413 aa,N端含有2个B-box盒,C端含有1个CCT结构域。系统进化树分析发现,PhBBX8与拟南芥AtBBX8等聚类为一支。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性,结果表明该基因在花中表达量较高,其次为根,而在茎和叶中表达较弱;利用实时定量PCR检测了在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下矮牵牛叶片中PhBBX8的诱导表达情况,结果表明,PhBBX8表现出不同程度的上调,其中除干旱胁迫外,其他胁迫下上调倍数都较高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温等非生物逆境相关。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHY1的克隆与表达分析

 根据植物C3HC4型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物, 通过RT2PCR结合RACE 方法从菠萝(Ananas comosus L. Merr) 幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长, 将其命名为AcRCHY1。该基因cDNA全长1 261 bp, 开放阅读框ORF为918 bp, 推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽。AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4 (RING finger) 和CHY两个锌指结构域, 与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%～91%。半定量RT-PCR分析表明, AcRCHY1 在菠萝中呈组成性表达, 在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶; 低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后, AcRCHY1在叶片中的表达明显增强。因此, AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关, 而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHYI的克隆与表达分析

根据植物C3HCA型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物,通过RT-PCR结合RACE方法从菠萝(Ananas comosus L.Merr)幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长,将其命名为AcRCHY1.该基因cDNA全长1 261 bp,开放阅读框ORF为918 bp,推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽.AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4(RING finger)和CHY两个锌指结构域,与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%-91%.半定量RT-PCR分析表明,AcRCHY1在菠萝中呈组成性表达,在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶;低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后,AcRCHY1在叶片中的表达明显增强.因此,AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关,而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径.     

枳抗逆基因PtrZPT2-2 的克隆与表达分析

 通过电子克隆和RT-PCR 法从枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]中克隆到1 个C2H2 型锌指蛋 白家族基因,命名为PtrZPT2-2。该基因编码159 个氨基酸残基,预测蛋白分子量为17.28 kD,等电点为 9.51。PtrZPT2-2 包含两个C2H2 型锌指结构域,在其C–末端含有一个转录抑制结构域EAR/DLN-box （DLNL）。PtrZPT2-2 与其他植物参与各种非生物胁迫反应的C2H2 型锌指蛋白有较高的一致性。系统发 育树分析表明PtrZPT2-2 与杨树PtaZFP2,矮牵牛ZPT2-12、ZPT2-13,拟南芥ZAT12、ZAT7 亲缘关系较 近。半定量PCR 分析表明,低温、高盐、干旱胁迫和ABA 处理下枳叶、茎、根中PtrZPT2-2 均被诱导上 调。PtrZPT2-2 可能在枳适应低温、高盐、干旱等非生物胁迫和ABA 响应中起着重要作用。     

矮牵牛冷响应转录因子PhZPT2-12的特性及表达分析

从矮牵牛‘H’自交系中分离获得1个响应低温胁迫的C2H2型锌指蛋白基因PhZPT2-12,其开放阅读框为525 bp,编码1条含有两个典型的C2H2型保守结构域,长度为174 aa的氨基酸多肽链。系统进化树分析表明,PhZPT2-12与已报道的Sl ZF3亲缘关系较近。亚细胞定位和转录激活活性分析显示,Ph ZPT2-12定位于细胞核,是一种核蛋白,并且其全长在酵母细胞中不具有转录激活活性。半定量RT-PCR表达分析结果表明,正常生长条件下PhZPT2-12在矮牵牛根、茎、叶中表达量较高,而在成熟的花中仅有微弱表达;在低温、高盐和干旱胁迫处理下PhZPT2-12表现出不同程度的上调,其中对低温胁迫最为敏感,上调倍数最高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温、高盐等非生物逆境相关。     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况，以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员，并进一步筛选其互作蛋白，为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础，获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况，应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证，并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因，随机分布于7条染色体上，都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域，均属于碱性不稳定亲水蛋白；聚类分析表明，葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族，其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近，VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明，VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

丹参转录因子SmWRKY1基因克隆及遗传转化拟南芥

以丹参为试材,提取总RNA和合成cDNA,采用PCR扩增获得丹参转录因子SmWRKY1基因序列,通过生物信息软件及在线工具检测基因编码蛋白质的理化性质及氨基酸多序列比对,构建过表达载体并使用花序侵染法转入拟南芥,研究了转SmWRKY1基因对拟南芥生长性状和生理指标的影响,以期初步探究丹参SmWRKY1转录调控因子的生物学功能。结果表明：SmWRKY1基因全长1 041 bp,编码346个氨基酸,NCBI数据库保守区BLAST分析显示具有典型的“WRKY”DNA结合保守结构域和C₂H₂型锌指结构。编码蛋白分子量为37 310.4 Da,等电点pI为9.77,GRAVY为-0.571,ProtParam分析SmWRKY1属于亲水性蛋白。构建过表达载体pCAMBIA-SmWRKY1,并使用花序侵染法转入拟南芥,经鉴定获得11株转SmWRKY1基因的阳性苗,转基因植株可以使叶片和莲座直径显著变大,叶绿素和可溶性糖含量增加,MDA和脯氨酸含量减少,因此推测丹参SmWRKY1可能是一个与植物基础防御有关的负调控因子,参与植物非生物胁迫反应。     

核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】Q型C2H2锌指蛋白在植物抵抗非生物胁迫中起重要作用。为深入了解核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族在核桃全基因组中的特征,对核桃Q型C2H2锌指蛋白(JrZFP)基因家族进行全基因组鉴定与分析,并研究其在核桃干旱和盐胁迫应答过程中的表达模式。【方法】利用生物信息学方法鉴定了核桃全基因组中的Q型C2H2锌指蛋白基因家族成员,并对其理化性质、染色体定位、进化关系和基因结构进行分析;根据JrZFP基因家族进化树随机挑选15个JrZFP基因,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)方法检测15个基因在干旱和盐胁迫下的响应特性。【结果】在核桃中共鉴定出82个Q型C2H2锌指蛋白基因,其蛋白质序列长度介于59～636个氨基酸之间,亚细胞定位主要位于细胞核中;该基因家族成员不均匀分布在15条染色体上,其中有11对JrZFPs基因为串联重复基因,63个JrZFP基因参与片段重复事件;基因结构分析表明,75个JrZFP基因无内含子,其余成员含有1～10个外显子;上游启动子区分析发现,该基因家族成员含有参与逆境胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。...     

西瓜bHLH转录因子家族基因的鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

利用生物信息学方法,在西瓜测序基因组97103中共鉴定出96个bHLH家族成员,其中有94个可以被定位到西瓜的11条染色体上。通过基因结构和结构域序列保守性的预测,发现这些基因的序列长度和内含子数量变化很大,但bHLH结构域序列比较保守。用拟南芥中39条已知的bHLH蛋白序列和西瓜的96条bHLH蛋白序列构建系统发育树,结果显示西瓜的bHLH家族可以进一步被分为11个亚族。运用荧光定量实时PCR技术,分析了该家族中21个基因在西瓜响应非生物胁迫时的表达水平,结果表明,8个基因受低温胁迫诱导表达,13个基因受ABA胁迫诱导表达,14个基因受盐胁迫诱导表达。ClabHLH41在3种胁迫下表达量均显著增加,说明其在低温、ABA和盐胁迫应答中可能发挥着重要作用。     

光皮桦BBX类基因BlCOL13的克隆与表达分析

利用RACE、RT-PCR以及基因组步移技术克隆得到光皮桦BlCOL13全长cDNA（GenBank登录号：KP663425）、全长DNA及其启动子序列。该基因DNA全长2 808 bp,具有4个外显子,3个内含子;cDNA全长1 370 bp,包含1 140 bp的开放阅读框,编码含379个氨基酸的蛋白。BlCOL13蛋白N、C端分别有两个B-box和一个CCT结构域,属于典型的BBX蛋白。以拟南芥中BBX蛋白的分类为参照,通过聚类分析表明BlCOL13属于Ⅱ型BBX蛋白;克隆得到的BlCOL13启动子序列长685 bp,含有多个与成花、光响应、激素信号转导以及逆境胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位试验结果表明该基因主要在细胞核中表达。不同组织中该基因都有一定程度的表达,但在雄花中表达量最高。低温、干旱、ABA和盐胁迫等非生物逆境都在一定程度上诱导BlCOL13的表达,盐胁迫的影响最为明显,表明该基因在光皮桦逆境响应中可能发挥比较重要的作用。     

转沙冬青锌指蛋白基因AmZFPG 烟草非生物胁迫抗性分析

 分析了沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）锌指蛋白基因AmZFPG 在非生物胁迫下的表达 特性,结果显示AmZFPG 受低温、干旱、高盐胁迫诱导表达,表明该蛋白参与多种胁迫相关的信号转导 和应答反应。为进一步探索AmZFPG 的功能,构建了真核表达载体AmZFPG-pCAMBIA2300,将该基因 转入烟草（Nicotiana tabacum L.）,对转基因烟草T1 代进行非生物胁迫分析,结果显示,转基因烟草的耐 寒性、耐旱性、耐盐性均获得了提高。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性,在生物信息分析的基础上,以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料,利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示,葡萄LIM基因家族有14个成员,可分为4个亚族,各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大,但亚族内差异较小;分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现,二者存在钝化选择关系;多序列比对发现,该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域;保守基序分析结果表明,所有基因均包含motif2;基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子;14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明,高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现,VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调,且随处理时间的延长表达量显著增加。     

低温胁迫下龙眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆与表达分析

 应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时发现碳酸酐酶（CA）蛋白下调表达。利用RT-PCR方法克隆CA基因的全长cDNA,GenBank登录号JN033201,长度为1 119 bp,包括1个966 bp的开放阅读框,编码321 bp的氨基酸序列,同源性分析表明,12个不同植物同源性为81% ~ 88%。龙眼CA基因具有典型的CA结构域,并且非常保守。实时荧光定量分析结果表明,CA在龙眼根、茎、叶中都有表达,为组成型表达,在叶中的表达量最高,茎和根中的表达量最少。CA基因在低温胁迫下随着低温胁迫时间的延长而发生变化。将CA在大肠杆菌中表达,获得1个约40.5 kD的外源蛋白。推测CA表达与低温胁迫有关。     

火龙果DREB1D基因的克隆及在转基因拟南芥中的功能分析

【目的】DREB(dehydration responsive element binding)是一类脱水响应元件结合蛋白，在植物响应高温、干旱、高盐和低温等多种非生物胁迫过程中发挥关键作用。以紫红龙火龙果（Hylocereus monacanthus）为材料，克隆得到DREB转录因子，并命名为HmDREB1D(HU02G01866.1)，探究其生物学功能。【方法】构建HmDREB1D基因植物过表达载体，通过亚细胞定位分析HmDREB1D基因在细胞中的位置。异源转化拟南芥，对T3代纯合系转基因拟南芥（OE3、OE4、OE5）进行生物学功能验证。【结果】火龙果HmDREB1D基因的开放阅读框全长723 bp，产生的蛋白定位于细胞核内，属DREB1s亚家族，具有典型的AP2结构域。将HmDREB1D基因转化至拟南芥获得超表达转基因株系，与野生型相比，转基因株系表现出较高的抗逆性。在干旱胁迫下，转基因植株T3代纯合系种子的萌发率高于野生型。转基因植株的叶片在逆境胁迫下表现出更低的电导率及更高的保护性酶活性。实时荧光定量PCR分析显示，RD20、HSP70和COR15A等逆境胁迫响应基因在Hm...     

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的表达及抗性分析

将蜡梅（Chimonanthus praecox）第3组LEA蛋白基因CpLEA在大肠杆菌中进行诱导表达,结果发现CpLEA重组蛋白在体外低温胁迫下能够保护乳酸脱氢酶的活性,且转CpLEA大肠杆菌的抗寒性有所提高;该基因在拟南芥中超表达,拟南芥的抗寒性和抗旱性均有所提高,且抗性的提高程度与基因过表达的积累量正相关,证实该基因能够参与植物的抗逆过程,在低温和渗透胁迫响应中发挥一定作用。通过qRT-PCR进一步分析花蕾期和露瓣期蜡梅瓶插花在低温（4℃）胁迫后CpLEA的表达特性,结果表明：与对照（22℃）相比,花蕾期CpLEA表达量在低温胁迫后逐渐升高,48 h达到峰值,约为未处理表达量的28倍,随后表达量下降,但仍然高于对照;露瓣期时该基因表达量随低温处理时间的延长逐渐升高,72 h后达到最高,约为未处理表达量的9倍。室温下蜡梅瓶插花中CpLEA的表达量基本恒定,而低温处理则可诱导该基因在蜡梅花发育早期表达量有不同程度的提高。     

枣树ZjSOD1基因参与非生物胁迫响应的研究

【目的】克隆1个枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD1,并对其功能进行研究,为其在枣树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础。【方法】采用PCR克隆ZjSOD1 cDNA序列,运用实时定量RT-PCR方法研究其在高盐和PEG6000胁迫下转录水平的变化。构建ZjSOD1过量表达载体转化拟南芥,研究其在拟南芥中响应非生物胁迫应答的功能,测定氧化酶活性及生理指标。【结果】ZjSOD1基因cDNA序列开放阅读框全长为699 bp,编码232个氨基酸,理论等电点为8.59,属于Fe-SOD家族成员。在转录水平上,ZjSOD1明显受NaCl和PEG6000诱导。在拟南芥中过量表达ZjSOD1基因导致植株对干旱、高盐更加敏感,但对H_2O_2耐受性显著增强。在NaCl、PEG6000和H_2O_2胁迫条件下,过量表达ZjSOD1转基因植株中SOD、CAT和POD酶活性、脯氨酸和丙二醛含量、电解质渗透率均显著发生改变。实时定量RTPCR结果显示参与活性氧(ROS)、高盐和干旱胁迫相关信号通路的基因在ZjSOD1转基因株系中表达量发生明显改变。【结论】ZjSOD1在植物生长发育过程中参与氧化、干旱、高盐胁迫应答。     

苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR，该基因全长639 bp，编码212个氨基酸，属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员，具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近，在不同物种间，与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近；理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白；结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域，三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示，CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著；对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析，‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高；‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高，干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达，表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

越桔VcWRKY33基因的分离及其响应胁迫的表达分析

以南高丛越桔"雷格西"Vaccinium corymbosum ‘Legacy’为试材,克隆与抗逆相关的WRKY基因,分析其表达模式及其对高盐、低温、渗透(PEG6000)和水杨酸处理的响应。结果表明,克隆获得越桔VcWRKY33基因,其编码蛋白含有2个WRKYGQK结构域和1个C2H2锌指结构。VcWRKY33在不同组织器官中均可表达,但表达量差异明显,在幼叶中表达量较高。该基因明显受高盐、低温、PEG 6000和水杨酸诱导表达。VcWRKY33在越桔的抗盐及抗寒等过程中可能起重要作用。     

龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析

应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时,发现PIP1蛋白在龙眼低温胁迫中上调表达。应用RACE技术克隆龙眼水通道蛋白基因全长cDNA,命名为DLPIP1,基因登陆号为JN572691,长度为1 132 bp,包括1个900 bp的开放阅读框,编码299个氨基酸序列,同源性分析表明,DLPIP1在21个不同植物中的一致性为90%~93%。应用生物信息学软件对DLPIP1氨基酸序列分析表明,含有7个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其他物种PIP质膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。利用实时荧光定量技术对DLPIP1在低温胁迫下不同组织表达谱分析表明,DLPIP1在龙眼根、茎、叶中都有表达,在根中的表达量最高,其次是茎和叶。DLPIP1在低温胁迫时,随着低温胁迫时间的延长而发生变化。这说明DLPIP1蛋白在龙眼低温逆境过程中起作用。