猪萨佩罗病毒VP1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪萨佩罗病毒(PSV)是一种小RNA病毒,在临床上多与猪流行性腹泻病毒、捷申病毒等引起混合感染.近年来,我国多个省份报道在猪体内分离到该病毒,因而有必要加强对PSV的相关研究.参照PSV-HuN2株序列,将VP1基因插入pGEX-6p-1中进行重组蛋白表达.将蛋白质溶液与弗氏佐剂混合,按照标准程序免疫6～8周龄BALB...     

猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。     

猪细小病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank发表的猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)中国株基因序列设计引物,通过PCR方法扩增到了PPV LJL12株NS1全长基因,将其克隆到原核表达载pET30a( )上,成功构建原核表达载体pET30a-NS1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为86 ku,与预期大小相符;Western blot分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性.NS1在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性,可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测.     

盖塔病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备盖塔病毒(GETV) E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对GETV E2蛋白的阳性杂交瘤细胞9E8,将该杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔内生产腹水。经间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验鉴定,该单抗可与GETV发生特异性反应。经IP试验证明,该单抗可识别天然结构的GETVE2蛋白。对E2单抗进行抗原表位鉴定,确定其所识别的多肽序列为⁶⁶KIRYIAGHD⁷⁴。与GenBank上登录的其他GETV毒株序列对比,发现该段序列高度保守。综上,E2单抗9E8免疫学反应特性良好,为研究该病毒提供了有效的免疫学检测工具。     

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV）S1蛋白的CHO细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。     

IBV S1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法,以IBVM41毒株的S1基因为模板扩增出了大小为468bp的目的片段(命名为poly156S1),该片断保守性、抗原性较好。将获得的目的基因定向克隆到表达载体pET-32a-c(+)中,获得了重组质粒pET-32a-c(+)-poly156S1。将该重组质粒转入表达菌Origami(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,获得了大小约为34KD的重组蛋白poly156S1。Western-blot证实该重组蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。用纯化好的重组蛋白poly156S1免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行单克隆抗体的制备,成功获得了针对M41S1蛋白的3株单克隆杂交瘤细胞8D2、8D6、10F9,其IgG亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型。按常规方法对各株单克隆杂交瘤细胞进行了小鼠腹水单抗的制备与纯化,并用以重组蛋白poly156S1为包被抗原的间接ELISA对纯化后的腹水单抗进行了效价测定,及其与重组蛋白poly156S1亲和力的分析。结果表明:腹水单抗8D2、8D6、10F9的ELISA效价分别达到1.78×218,1.37×221,1.31×216;单抗8D6与重组蛋白poly156S1的亲和力最高。Western-blot进一步证实单抗8D6与重组蛋白poly156S1具有良好的反应性。     

猪α干扰素基因的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

将猪IFN-α(poIFN-α)成熟蛋白基因克隆于pET-28a载体中,转染大肠杆菌,并进行诱导表达.经SDS-PAGE检测,融合表达的蛋白poIFN-α大小约27ku.收获融合表达的poIFN-α,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA方法对融合细胞进行检测,结果获得了1株能稳定分泌抗poIFN-α蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H12株.Western-blotting结果及单克隆抗体亚型鉴定结果表明,单抗与重组蛋白发生特异性反应,单抗为IgG1亚型,且轻链为κ链.     

新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]当前,新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)导致的疫情在全球大流行,严重危害人类的生命健康.研究拟制备并鉴定针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)的单克隆抗体,为SARS-CoV-2新型快速...     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

猪δ冠状病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

通过RT-PCR对采集自河北省2个猪场的5份腹泻仔猪小肠内容物进行检测,结果均为猪δ冠状病毒（PDCoV）阳性。将病料处理后接种LLC-PK1细胞,从2个猪场的病料中各成功分离到1株PDCoV,分别命名为PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株。通过间接免疫荧光试验（IFA）、Western blot和电镜观察对分离的病毒进一步鉴定,IFA和Western blot结果证实2株病毒都能与PDCoV M蛋白的单克隆抗体发生特异性反应,电镜下可观察到直径100～150 nm、呈典型皇冠状的病毒粒子,证实所分离的病毒为PDCoV。全基因组测序以及遗传进化分析结果表明,2株PDCoV与中国大陆毒株相似性较高,为98.7％~99.1％,与中国香港毒株处于同一簇。     

猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备

P46蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,且与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。制备针对该蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源。本研究取猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠,用大肠杆菌表达的P46蛋白作为筛选抗原制备了2株特异性单克隆抗体1A4和3C11。结果显示,2株单抗ELISA效价最高可达1∶64 000。Western-blot结果表明,2株单抗均能与原核表达的P46蛋白及猪肺炎支原体全菌蛋白中46 000大小的蛋白发生特异性反应;2株杂交瘤细胞株经3个月冻存或连续传代3个月均能保持较高的滴度。本研究成功制备了2株针对猪肺炎支原体P46蛋白的特异、稳定且高滴度的单克隆抗体。     

鸡新城疫病毒F基因片段的原核表达及其抗F蛋白单克隆抗体的制备

[目的]制备鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)抗原的单克隆抗体。[方法]克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段F306,经杂交瘤技术制备了抗F蛋白的单克隆抗体。[结果]首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以保存的重组质粒为模板,通过PCR扩增获得长度为306 bp的片段,再将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F306。其次经原核表达获得大小为35.8 kD的融合蛋白,提纯后免疫Balb/c小鼠。最后,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代和分泌抗NDV-F的抗体的杂交瘤细胞株。连续传代10次后,细胞上清和腹水的抗体效价仍维持在1∶5 124和1∶64 000以上。[结论]获得了2株稳定分泌抗鸡NDV-F抗体的杂交瘤细胞。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株单克隆抗体的制备

目的是经蔗糖密度梯度纯化PRRSV变异毒株,制备抗PRRSV的单克隆抗体。方法是用经纯化的PRRSV接种BALB/c小鼠后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合用间接ELISA筛选阳性克隆,对单抗进行特异性鉴定及亚型鉴定。结果是经4次单克隆筛选,获得5株具有稳定分泌特性,与PRRSV变异株呈阳性反应的细胞株。结论是所获得的抗PRRSV特异性单克隆抗体,可作为PRRSV感染的诊断和研究依据。     

猪肺炎支原体 P65蛋白的单克隆抗体的制备

P65蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。本实验应用原核表达的重组 P65蛋白免疫小鼠,用 Mhp全菌蛋白和P65蛋白筛选,制备了1株特异性单克隆抗体3G12。鉴定结果表明,该株单克隆抗体可与 P65蛋白和 Mhp全菌蛋白反应,采用间接 ELISA法测得3G12细胞培养上清与P65蛋白反应抗体的效价为1∶12800,与全菌蛋白反应抗体的效价为1∶3200;3G12腹水与P65蛋白反应的抗体效价为1∶4000000以上,与168全菌蛋白反应的抗体效价为1∶20000以上,细胞经长期体外培养和冻存后复苏能稳定分泌抗体。本研究成功获得到1株针对 P65和Mhp全菌的单克隆抗体,为猪肺炎支原体致病机制和检测方法的进一步研究提供了基础。     

基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备

基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白抗原表位所在的结构域,明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸残基附近。通过RT-PCR扩增出了目的片段,构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体,表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性。采用杂交瘤细胞技术,利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体,制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应。检验结果表明,制备的抗血清具较好的特异性,可应用于TRSV的检疫检验。     

猪细小病毒自然弱毒N株非结构蛋白NS1基因原核表达

为进一步探讨猪细小病毒自然弱毒N株（PPV-N株）的分子病原学机理,根据GenBank上已发表的PPV全基因组序列（登录号NC_001718）设计1对引物,通过PCR方法扩增获得PPV-N株NS1全长基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进而构建原核表达重组质粒pET32a-NS1,并在BL21（DE3）pLysS中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为90.0 kDa;Western blotting分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,且具有免疫原性,可作为PPV临床鉴别诊断抗原。     

两种来源的IBDV抗原制备单克隆抗体的比较

[目的]比较以原核表达蛋白与纯化病毒制备单克隆抗体的特性。[方法]RT-PCR扩增IBDVVP2基因,通过原核表达系统表达目的蛋白,并亲和纯化重组蛋白。尿囊液扩增IBDV,并通过超速离心纯化病毒。分别用纯化的重组VP2蛋白和IBDV免疫Balb/c小鼠,ELISA筛选杂交瘤细胞株。[结果]获得了2株分泌VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价均为1∶2×104;4株分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价分别为1∶2×106,1∶6×104,1∶1×105,1∶4×103。所有单克隆抗体均与其制备用免疫原反应,不与空载体或其他病毒抗原反应。经10～20次传代,仍保持稳定的效价。[结论]纯化的原核表达VP2蛋白和IBDV均能诱导小鼠产生免疫应答;用原核表达的VP2蛋白作为免疫原,可以获得特异的VP2抗体。     

猪日本乙型脑炎病毒NS5原核表达和多克隆抗体制备

提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.