AtMYB73基因正调控拟南芥对盐胁迫的响应

为明确拟南芥R2R3-MYB转录因子家族第22亚族基因AtMYB73在拟南芥抵抗盐胁迫过程中的功能,本研究将拟南芥野生型Col-0、AtMYB73基因的T-DNA插入突变体myb73和超表达突变体OE进行NaCl胁迫处理,检测突变体在NaCl胁迫下的种子萌发率、存活率及抗盐相关基因的表达情况。结果发现,在NaCl胁迫下,myb73突变体的种子萌发率、幼苗的存活率、成株时期的存活率及拟南芥抗盐相关基因MYB44、SOS2和SOS3的表达均明显低于野生型和超表达突变体,表明AtMYB73基因正调控拟南芥对盐胁迫的响应。     

敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性

以拟南芥类固醇类C22α-羟化酶基因DWF4的T-DNA插入缺失突变体dwf4为研究材料,通过观察突变体在低温胁迫条件下的表型,检测dwf4突变体和野生型在低温胁迫条件下的相对电导率、叶绿素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、抗冷基因表达量和过氧化物酶基因表达量的区别,探讨了该基因在抗低温胁迫反应过程中的功能。结果表明,敲除DWF4基因能够提高拟南芥对低温胁迫的抗性。dwf4突变体的抗低温胁迫能力一方面源于在低温胁迫下,与野生型相比,dwf4突变体中相对较低的电导率和较高的叶绿素含量,以及更多渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸的积累,另一方面源于低温胁迫条件下dwf4突变体中低温胁迫响应的下游基因RD29A及COR47的高表达。结果还表明尽管dwf4突变体中过氧化物含量增加,但是过氧化物酶基因Prx22与Prx698的高表达对过氧化物的毒害起到了很好的抑制作用。说明在拟南芥中DWF4负调控拟南芥对低温胁迫的反应过程。     

拟南芥跨液泡膜磷转运蛋白基因突变体的初步筛选

观察分析了拟南芥的编码转运蛋白和其相关基因,构建了T-DNA突变体。利用野生型拟南芥和构建的T-DNA突变体拟南芥在形态学上的差别,发现了一株可能新的耐磷突变体。通过对野生型拟南芥和磷饥饿突变体的对比分析,可以为植物在耐磷方面的研究提供重要的线索。     

硝酸还原酶介导的一氧化氮对植物铝胁迫耐受性的增强作用

以拟南芥野生型、一氧化氮(NO)产生途径相关突变体Atnoa1(NO合成酶缺失突变体)和nialnia2(硝酸还原酶缺失突变体)为材料,研究铝毒害对拟南芥野生型、Atnoa1和nialnia2的影响。试验结果显示,不同浓度(0~200μmol/L)Al Cl3处理抑制了拟南芥中根的生长,野生型和Atnoa1突变体表现出一致的抑制趋势,而nialnia2突变体中根生长的抑制程度更严重。进一步的结果显示,Al Cl3处理增加了拟南芥中丙二醛和活性氧(H2O2和O-2·)含量,野生型和Atnoa1突变体表现出一致的增加趋势,而nialnia2突变体中丙二醛和活性氧含量增加幅度更大;此外,Al Cl3处理显著增加了拟南芥中还原型抗坏血酸(As A)和谷胱甘肽(GSH)的含量,野生型和Atnoa1突变体表现出一致的增加趋势,而nialnia2突变体中As A和GH含量增加幅度最小。这些结果表明,硝酸还原酶途径介导的NO在增强植物抗铝毒害过程中起着重要的作用。     

活性氧不敏感型拟南芥突变体的遗传特性分析

[目的]研究活性氧不敏感型拟南芥突变体的遗传特性。[方法]拟南芥种子经消毒后,在MS固体培养基上进行培养。培养5~6d后,将幼苗移栽于蛭石上继续培养。开花时,以野生型为父本,突变体为母本,进行杂交,成熟时收获得到F1代种子。将F1种子种于MS培养基上,生长5~6 d后,用10-4mol/L的H2O2处理幼苗,用根弯曲法检测植株对H2O2抗性表现,进行遗传分析。[结果]F1代幼苗,全部不抗H2O2,即根的生长受到抑制。在243个F2代植株中,有184株不抗H2O2,59株抗H2O2,不抗与抗的植株数呈现3∶1的分离。[结论]活性氧不敏感型拟南芥突变体发生了隐性单基因突变。     

拟南芥抗日本曲霉毒素SAF突变体的筛选

黑麦酮酸F(SAF)是从日本曲霉(Aspergillus japonicus)中分离的化感物质。以拟南芥为材料,在萌发期和幼苗期分别以0.250、0.300 mmol/L SAF为选择浓度,根据种子是否萌发和幼苗能否存活为指标,并结合细胞死亡、MDA含量、H2O2含量等植物生理生化指标初步筛选得到拟南芥抗SAF突变体Hst 1,为进一步研究SAF的化感作用机理提供试验材料,也为拟南芥突变体的快速筛选技术提供参考依据。     

转ZmHAK1拟南芥的表型及吸钾量

测定了不同浓度低钾处理条件下的拟南芥吸钾量和根伸长量以及一些性状指标如千粒重、株高、角果长、开花时间等。结果表明:转基因拟南芥开花时间早于突变体;子粒千粒重大于突变体;在介质中钾浓度一定范围内,介质的钾含量越低,转基因拟南芥的根伸长量越显著大于突变体的,说明转基因拟南芥对低钾胁迫有更好的适应性。与拟南芥突变体相比,转基因拟南芥的吸钾量较大,说明转基因拟南芥在低钾胁迫下有较强的吸钾能力。     

拟南芥响应NO突变体的筛选及遗传分析

从甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得的拟南芥突变体库中筛选对一氧化氮(NO)胁迫敏感的突变体,以期为研究信号分子NO在植物中的分子调控机制提供遗传材料。从EMS诱变获得的拟南芥突变体库中筛选得到1株对NO敏感的突变体nsm1(nitric oxide sensitive mutant 1),在正常生长条件下,突变体nsm1与野生型拟南芥的表型并没有明显区别,但是对NO胁迫的敏感性明显高于野生型拟南芥,在50μmol/L SNP(NO供体)处理下,野生型拟南芥的相对根长(与在正常生长的根长比值)为50.8%,而突变体nsm1的相对根长为22.4%。进一步研究发现,突变体nsm1对甘露醇模拟的干旱胁迫敏感,在100 mmol/L甘露醇处理下,野生型拟南芥的相对根长为83.4%,而突变体nsm1的相对根长仅为45.7%,这可能与突变体nsm1的失水率、水势、气孔导度和蒸腾速率高于野生型拟南芥有关。遗传学分析表明,该突变体为单基因隐性突变。     

拟南芥类锌指基因AT3G02790/AT5G16470纯合双突变的筛选及其表型分析

以拟南芥T-DNA插入突变体AT3G02790和AT5G16470为亲本,通过人工杂交技术获得杂合体后,结合基因分离定律和PCR技术筛选出拟南芥纯合双突变株,并对拟南芥纯合突变体的表型进行了初步分析,结果显示:突变体与野生型植株表型无明显差异,推测该基因为功能未知的新基因。     

拟南芥黄化突变体k60的基因作图定位

拟南芥黄化突变体k60是从甲基磺酸乙脂诱变的拟南芥突变体库中筛选得到的。该突变体表现为叶色发黄,生长迟缓,叶绿素含量降低。遗传分析发现其为单基因控制的隐性突变。利用遗传作图的方法将突变基因定位于拟南芥5号染色体上CH5-6.0到CH5-6.24两个分子标记之间的231 kb区间内。本项工作的研究结果为该突变基因的鉴定奠定了前期基础,并且为研究拟南芥黄化基因的功能提供了新的实验材料。      

转PcRS基因拟南芥植株表型分析

为了研究虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)白藜芦醇合酶基因PcRS的功能,以转PcRS基因拟南芥为材料,对其进行分子鉴定和表型研究.利用Southern blot和Northern blot验证了外源PcRS基因在转基因拟南芥基因组中的整合和表达.对经过选育得到的T3代纯合株系(L4、L6、L15)进行性状观察.在体视显微镜下观察野生型和转基因拟南芥植株表型;采用分光光度法测定低氮培养基上的子叶花青素含量.结果显示,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥的种皮颜色发生改变呈浅黄褐色,并且子叶中花青素含量显著减少.这表明PcRS基因可能导致转基因拟南芥的黄酮类物质合成受阻.     

拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

植物对病原物的抗性是一个很复杂的生命现象。目前人们认识到植物的抗病过程有很多基因和一些相互关联的信号传导途径参与。人们对植物抗病的分子机制的了解,很多是来自以拟南芥作为材料所进行的大量研究。对植物抗病性的了解是一步步深入的,其进展与研究方法和技术的不断改革密不可分,其中实验材料的模式化使得研究更加集中、更具有通用性,所使用的资源更丰富,强有力地推进了研究的深入进行。在此,对拟南芥这个模式植物在植物抗病性的遗传和分子机制研究中的作用做了阐述。     

3种植物Ran基因的克隆及序列分析

［目的］研究洋葱、大蒜和油菜中Ran基因与拟南芥Ran2基因的同源性,以确定3种植物材料能否作为拟南芥的替代材料研究Ran的定位。［方法］采用RTPCR方法,以拟南芥Ran2的引物分别从洋葱、大蒜和油菜分裂细胞提取的总RNA中克隆出同源基因,进行测序、比对分析。［结果］洋葱、大蒜和油菜的Ran基因开放阅读框分别为666、663和666bp;分别编码221、220和221个氨基酸,分子量约24.3kD;与拟南芥AtRan2氨基酸序列同源性分别为99.1%、100.0%（除末端缺少1个天冬氨酸D外）和96.4%;进化树分析显示洋葱和大蒜Ran基因与拟南芥进化关系更近。［结论］为进一步研究植物Ran基因的生物学功能奠定了基础。     

盐胁迫对拟南芥叶片和下表皮细胞大小的影响

[目的]探讨盐胁迫对拟南芥叶片发育的影响。[方法]用浓度分别为0、100和150 mmol/L的NaC l溶液处理拟南芥幼苗7和14d后,用改进的指甲油印迹法并借助计算机软件,测量了不同处理的叶片面积和下表皮细胞面积。并对不同处理的叶片和细胞面积进行了差异性检验和比较。[结果]盐胁迫下,拟南芥叶片的生长受到显著抑制。叶片大小、叶片下表皮细胞的大小都相应减小。[结论]叶片及表皮细胞的减小是植物盐胁迫条件下的重要生理反映。     

玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究

[目的]优化玉米和拟南芥原生质体的制备条件及瞬时表达体系.[方法]以不同时期玉米叶片和拟南芥为材料分离原生质体,通过对不同酶浓度,解离时间和渗透压的研究,优化最佳分离原生质体体系;原生质体再经PEG介导的转化,通过GFP基因表达百分比鉴定原生质体活性和转化效率.[结果]玉米和拟南芥原生质分离的最佳条件为：纤维素酶1.5％,离析酶0.5％;拟南芥酶解4h,甘露醇浓度0.4 mol/L;玉米酶解6h,甘露醇浓度0.45 ～0.50 mol/L.最佳生长时期为：拟南芥6～8片叶;玉米二片叶.用去内毒素质粒经PEG（玉米30％ PEG,拟南芥40％ PEG）诱导转化置于黑暗下培养,原生质体活性和转化效率较高,原生质体中可以观察到明显的GFP荧光.[结论]玉米和拟南芥原生质体的制备受酶浓度,解离时间和渗透压的影响,在原生质体转化过程中,质粒DNA纯度,PEG浓度等是影响转化效率的关键因素,与拟南芥原生质体相比玉米原生质体要稳定性差一些.     

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。     

玉米昼夜节律钟基因CCA1的克隆及表达分析

昼夜节律钟基因CCA1在调解水稻和拟南芥的光周期反应中起着重要作用。本研究利用从水稻和拟南芥中分离到的CCA1基因序列作为靶序列BLAST获取Genbank中的信息,通过RT-PCR方法克隆获得了一条2326bp的玉米CCA1基因cDNA序列。BLAST比对发现其与水稻、大麦和拟南芥的序列相似性分别达73.7%、69.4%和39.8%。利用NCBI中的ORF Finder软件分析,发现该序列包含一个2163bp的开放阅读框,编码720个氨基酸残基,蛋白的分子量约为78819.17Da,等电点为6.468。推测其含有3个myb-DNA结合域、7个N-豆蔻酰化位点、1个G-box蛋白结合域以及1个蛋白跨膜结合域。采用实时荧光定量PCR分析发现,随光照时间的变化,该基因在玉米叶片中的表达量呈现出白天不断降低而夜晚逐渐升高的昼夜变化趋势。本研究为进一步研究玉米CCA1基因在调控玉米光周期敏感现象中的功能,阐明玉米光周期敏感机制提供了科学依据。     

SSMP的结构解析及在拟南芥抗盐过程中的作用

【目的】解析SSMP（salt-sensitive membrane protein）的结构,明确SSMP的表达特性,预测和分析SSMP在拟南芥逆境胁迫过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,解析SSMP的结构特征;利用Real-time PCR技术分析SSMP的时空表达特性;利用SSMP-GFP融合技术转化拟南芥叶片原生质体,对SSMP进行亚细胞定位;构建SSMP的启动子连接报告基因GUS的表达载体,转化野生型拟南芥,通过染色方法观察报告基因GUS的表达情况,从而进行SSMP的组织定位分析;构建SSMP过表达载体,利用农杆菌侵染花絮法转化拟南芥,qRT-PCR技术验证过表达SSMP拟南芥阳性苗,分析过表达SSMP拟南芥的表型并进行抗逆性分析,明确SSMP的生物学功能;利用电导仪法比较过表达SSMP拟南芥和野生型拟南芥叶片的细胞膜透性,分析SSMP在拟南芥抵抗逆境胁迫过程中的作用。【结果】生物信息学分析表明,SSMP含有START（the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains）保守域、共411个氨基酸,具有磷脂酰胆碱的结合位点,预测SSMP可能影响膜的组成。对SSMP的高级结构进行解析,SSMP含有9个反平行的β-折叠和2个α-螺旋,形成1个明显的疏水腔,N端的α-螺旋在疏水腔外,另一个α-螺旋形成疏水腔的盖子结构。Real-time PCR对拟南芥的不同组织及发育时期的SSMP表达量的分析表明,SSMP在拟南芥各组织中均有表达,表达量由高到低的顺序依次为茎生叶、莲座叶、茎、根、花和种子。SSMPpro::GUS转基因拟南芥幼苗的染色结果表明,在正常情况下,GUS主要在下胚轴、整个子叶和真叶的叶脉及表皮毛处表达;50 mmol·L^-1 NaCl处理后,GUS在下胚轴和子叶中表达没有明显的变化,但在真叶中的表达减少;100 mmol·L^-1 NaCl处理后,GUS的表达在下胚轴、子叶和真叶中都明显减少,子叶中GUS主要在叶脉处表达,在真叶中仅在顶端还有表达,这说明SSMP的表达受NaCl抑制。激光共聚焦显微镜488 nm波长下对SSMP-GFP的亚细胞定位进行观察,SSMP主要定位在细胞质膜上。过表达SSMP转基因拟南芥的细胞膜透性增加,不利于植物的抗逆性。进一步的萌发试验对过表达SSMP的转基因拟南芥的萌发率和转绿率进行了统计分析,结果表明,过表达SSMP明显抑制拟南芥种子的萌发。【结论】SSMP是具有磷脂酰胆碱结合位点的共411个氨基酸的蛋白质,含START结构域,主要位于细胞质膜上;在拟南芥各组织中均有表达,尤其在叶片中表达量最高,主要定位在整个子叶和真叶的叶脉及表皮毛着生处;SSMP的表达受盐胁迫的抑制;过表达SSMP的拟南芥细胞膜透性增加,耐盐性降低。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

拟南芥热激因子HSF1的表达与纯化

[目的]表达和纯化拟南芥热激因子HSF1。[方法]以构建的能表达热激因子HSF1的大肠杆菌Escherichia coli M15（pQE32／His6-HSF1,pREP4）为材料,用异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达HSF1,再通过镍亲和层析纯化表达的HSF1,通过变性的聚丙酰胺（SDS．PAGE）电泳分析表达蛋白和纯化蛋白。[结果]试验获得了表达的HSF1,并且进一步获得了纯化的HSF1。[结论]该研究为探讨拟南芥HSF1在基因组的结合位点提供了试验材料,为全面认识HSF1作用机理和生理功能奠定了基础。