大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。     

热敏肠毒素促进产肠毒素大肠杆菌对小肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附的初步研究

本试验利用PCR技术,以K88ac标准株C83902基因组DNA为模板扩增出热敏肠毒素(heat-labile toxins,LT)基因,大小约1.1 kb。将其克隆入表达质粒载体pACYC184,构建和筛选出含正确插入LT基因的pACYC-LT重组质粒。采用同样方法,构建和筛选出两种含点突变LT基因的重组质粒(pACYC-LT72和pACYC-LT192)。进一步将上述重组质粒DNA转化入不表达任何毒素的大肠杆菌SE5000株。GM1-ELISA结果表明,上述重组菌均能在体外正常表达LT毒素蛋白。以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,比较了表达和不表达LT的细菌对细胞黏附性能。数据表明,LT的表达使细菌对肠上皮细胞的黏附效应明显增加(12.3±3.4倍)。两种LT毒素蛋白的单氨基酸突变体的表达证明了LT毒素的ADP核糖基化作用对其增强致病菌对肠细胞的黏附作用是必要的。蛋白激酶A的抑制剂Rp-cAMP、腺苷酸环化酶的抑制剂DDA和LT毒素的受体GM1都可阻断LT毒素对细菌黏附性能的提升作用。     

大肠埃希菌不耐热肠毒素研究进展

大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)是产毒性大肠埃希菌产生的一种能导致人畜腹泻的毒素,由六聚体蛋白形成AB5型结构.A亚基具有ADP核糖基转移酶活性,而B亚基为五聚体,主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合.LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性.为了将其毒性与佐剂活性分开,研究者构建了一系列无毒或减毒的突变体.证明突变体具有佐剂活性,并发现没有毒性的AB复合物以及酶活性在佐剂活性中发挥的作用是分开的.野生型LT、LT突变体以及B亚基与外源抗原共同免疫机体后,对机体免疫系统具有调节作用.     

犬抗细粒棘球绦虫疫苗候选蛋白EgM9的原核表达及纯化

把含有EgM9基因的质粒pET-41b转化至大肠杆菌BL-21中，IPTG诱导重组质粒的表达，亲和层析纯化表达产物，用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定，显示分离纯化的EgM9和GST蛋白纯度较高，1L的培养物约可以得到5mg纯化蛋白，分子量为60kDa。EgM9免疫后的血清与成熟虫体蛋白有特异性反应。融合蛋白获得高效表达，并成功纯化，初步实验证明EgM9具有良好的免疫原性，可进一步用于疫苗的免疫实验。     

大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性，实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条引物，采用突出末端PCR法和重组PCR法，将克隆于质粒pEWD299上的LT基因，分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点，扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112突变点的约1100bp和约800bp的DNA片段和不含突变点的约300bp的DNA片段，使控制LT毒力活性中心的第7位和第112位氨基酸的碱基分别发生诱变，各DNA片段经分熟、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后，插入经BamHI和XhoI双酶切的线性化的高效表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点区，使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达，将连接产物转化入JM105菌株，挑出可疑阳性菌落，提取质粒，经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析，证明读框正确，序列正确，获得了pGEX-4T-1(LT7t GEX-4T-1(LTm112两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人 动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂，完成了基因水平的工作。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂，试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白，采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌，以镍柱对重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体，以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性，并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明：PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因，并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带，纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000～1∶500...     

科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。     

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。     

新孢子虫NcGRA2t基因的原核表达及鉴定

为研究新孢子虫GRA2t基因的原核表达及其表达产物的免疫活性,用EcoRI和XhoI限制性内切酶从pMD20-NcGRA2t上切下NcGRA2t基因,克隆入pGEX-4T1中构建NcGRA2t-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-4T1-NcGRA2t。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱甘肽-琼脂糖层析柱进行纯化。用Westernblotting方法,以犬感染新孢子虫Ncl株的血清鉴定表达产物的活性。结果,构建了pGEX-4T1-NcGRA2t原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达分子量为46 ku的NcGRA2t-GST融合蛋白,表达产物经谷胱甘肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的NcGAR2t蛋白。Westernblotting结果显示,表达产物具有生物学活性。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达及其GM1结合活性分析

为获得表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的乳酸菌表达系统,并分析其免疫反应性和神经节苷脂受体(GM1)结合活性,本研究将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建重组质粒pPG-2-eltb,电转化于干酪乳杆菌393中。筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot和间接ELISA方法鉴定LTB表达情况,并检测其与GM1结合活性。结果显示,目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。GM1-ELISA试验结果证实表达的LTB可与牛GM1特异性结合。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料,进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析,为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高,为100%,软枝酸橘最低,为88.9%;随着干旱胁迫加剧,各品种的旱害指数呈上升趋势,长寿金柑的旱害指数最低,为0.25,软枝酸橘的旱害指数最高,为0.61;从叶片相对含水量的结果来看,长寿金柑的变化幅度最小,软枝酸橘的变化幅度最大,在第18d时分别为61.19%和37.85%;3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度,其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析,得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。     

重构胚移植用受体山羊同期发情处理效果比较

分别用CIDR（孕酮阴道栓）＋PMSG（处理1）和CIDR＋PMSG＋LH（处理2）两种处理方法对山羊进行同期发情处理。结果发现,两种处理均以撤栓后第1d发情率最高。撒栓后0-24h和24h-48h的发情率,处理1和处理2（61．4％,13．6％和48％,20％）之间差异不显著;撤栓后48h-72h的发情率,处理1（4．59,6）显著低于处理2（24％）（P〈0．05）;撤栓后0～72h发情率,两种处理（79．5％,92％）无显著差异（P〉0．05）。从手术时对卵巢的观察可以看出,有大卵泡或排卵的发情羊,处理1为91．2％,处理2为100％,二者无显著差异;排卵的发情羊,处理1为（58．8％）显著低于处理2为（91．2％）（P〈0．05）。