四种饵料对瘤背石磺生殖性能的影响

比较了螺旋藻粉(A组)、玉米粉(B组)、面粉(C组)和发酵猪粪(D组)四种饵料对成体瘤背石磺摄食、成活、产卵量和卵质量的影响.结果表明,(1)不同饵料对亲本的成活率无显著影响,各组成活率均在90%以上,面粉对亲本瘤背石磺具有较好的诱食性,发酵猪粪组的瘤背石磺摄食量较小;(2)B、C两组亲本的产卵总量明显大于A、D两组,其平均产卵量分别为每只亲本7.27×104个和6.79×104个,A、D两组亲本的平均产卵量仅为B、C两组的70%左右.B、C两组亲本的产卵高峰出现在8月26日左右,而A、D两组则出现在8月28-30日之间;(3)A组胚胎发育速度较快,孵化率达73.97%,显著高于其它三组(P＜0.05),C组孵化率次之(38.26%),D组胚胎孵化率最低(7.71%),且胚胎发育不同步,孵化时间长达19～22 d.由此可见,面粉和玉米粉有利于提高瘤背石磺亲本的产卵量,螺旋藻粉组亲本的胚胎具有较高的孵化率.     

瘤背石磺产卵规律与天文潮汐关系

为了开展瘤背石磺人工增养殖技术以满足日益增长的市场需求,弄清瘤背石磺的产卵规律是至关重要的。该实验比较三年来瘤背石磺产卵规律趋势,以及潮汐潮高与产卵周期关系,从2013年至2015年,在每年的7月到9月间连续购进同地区的野生瘤背石磺,选取同等规格的瘤背石磺暂养后记录每批瘤背石磺产卵情况,并与潮汐规律以及潮位高度相比较。结果显示:按农历计算,瘤背石磺在每个月的小潮(初七、二十三)前后集中大量产卵,维持6~7 d,在大潮(初一、十五)来临之前一至两天结束产卵,趁大潮时的潮水运动将已出膜的幼体带入海洋。在海水中经过15 d左右的发育,待瘤背石磺发育至大面盘幼虫期时再随下一次大潮回到滩涂。根据结果可以得出以下结论:(1)瘤背石磺的产卵规律与天文潮汐相关,呈现出伴随着小潮出现一次产卵高峰,并且会在开始产卵后的两至三天内出现峰值;(2)理论上说,从小潮到下一个小潮为14 d 19 h55 min,实际上,由于潮汐的迟滞性等原因,瘤背石磺的产卵周期为14 d 21 h 20 min。     

瘤背石磺对 9 种常规饲料原料中营养物质的表观消化率

以0.5%的三氧化二铬(Cr2O3)为外源指示剂,由70%基础饲料(螺旋藻)和30%试验原料组成试验日粮,研究瘤背石磺(Onchidium struma)对鱼粉、肉骨粉、豆粕、玉米蛋白粉、棉籽蛋白粉、菜粕、棉籽粕、小麦粉和玉米粉9种饲料原料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、氨基酸、钙及总磷的表观消化率。试验选用初均重(16.82±2.14)g的瘤背石磺2 400只,随机分成10组,每组3个重复,每个重复40只,且以饲喂螺旋藻粉组为对照组。结果显示,9种饲料原料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、总氨基酸、必需氨基酸、钙和总磷的表观消化率的范围分别为33.24%～55.29%、27.30%～79.35%、36.91%～69.81%、34.89%～65.04%、25.35%～75.78%、21.54%～72.57%、44.98%～74.64%和10.42%～32.15%。在7种蛋白饲料中,以玉米蛋白粉的各项营养物质的表观消化率较高,棉籽蛋白粉和棉粕次之;在两种能量饲料中,以玉米粉的各项营养成分的表观消化率较高,但低于玉米蛋白粉。由此可见,玉米蛋白粉可作为瘤背石磺优质饲料原料来替代或部分替代螺旋藻;同时,玉米粉和棉籽蛋白粉也可以作为重要的饲料原料合理搭配、适量使用。     

瘤背石磺对9种常规饲料原料中营养物质的表观消化率

以0.5％的三氧化二铬(Cr2O3)为外源指示剂,由70％基础饲料(螺旋藻)和30％试验原料组成试验日粮,研究瘤背石磺(Onchidium struma)对鱼粉、肉骨粉、豆粕、玉米蛋白粉、棉籽蛋白粉、菜粕、棉籽粕、小麦粉和玉米粉9种饲料原料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、氨基酸、钙及总磷的表观消化率.试验选用初均重(16.82±2.14)g的瘤背石磺2 400只,随机分成10组,每组3个重复,每个重复40只,且以饲喂螺旋藻粉组为对照组.结果显示,9种饲料原料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、总氨基酸、必需氨基酸、钙和总磷的表观消化率的范围分别为33.24％ ～ 55.29％、27.30％ ～ 79.35％、36.91％ ～69.81％、34.89％ ～ 65.04％、25.35％ ～ 75.78％、21.54％ ～ 72.57％、44.98％ ～ 74.64％和10.42％ ～ 32.15％.在7种蛋白饲料中,以玉米蛋白粉的各项营养物质的表观消化率较高,棉籽蛋白粉和棉粕次之;在两种能量饲料中,以玉米粉的各项营养成分的表观消化率较高,但低于玉米蛋白粉.由此可见,玉米蛋白粉可作为瘤背石磺优质饲料原料来替代或部分替代螺旋藻;同时,玉米粉和棉籽蛋白粉也可以作为重要的饲料原料合理搭配、适量使用.     

瘤背石磺代谢蛋白PAK2基因的克隆、相对表达量及进化分析

p21活化蛋白激酶2(PAK2)在生物中具有促进细胞增殖生长、抗凋亡等重要作用,可激活细胞增殖生长相关基因的表达。为探究PAK2基因在石磺细胞增殖代谢中的作用,通过RACE技术克隆得到瘤背石磺(Onchidium reevesii)PAK2基因的cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析PAK2基因在不同组织中的相对表达情况。结果表明,瘤背石磺PAK2基因cDNA全长1 809 bp,包含1 488 bp的开放阅读框,共编码495个氨基酸,基因序列较为保守。序列分析结果显示,瘤背石磺和光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)PAK2基因相似度达到83%,氨基酸序列同源性高达88%。通过生物进化分析研究得出瘤背石磺与绿色海蜗牛(Elysia chlorotica)的进化关系相对较近。q RT-PCR结果显示,肠道和背部PAK2基因表达量明显高于其他组织,其次为神经组织和肝胰腺,腹足、口器和性腺的表达量处于中等水平,而蛋白腺表达最低。初步阐明了瘤背石磺PAK2基因的生物信息学特征以及在各组织中的表达水平,为研究其在石磺科贝类中的具体作用机理奠定了基础。     

响应面法优化胃蛋白酶酶解瘤背石磺肌肉蛋白工艺参数

为了优化胃蛋白酶酶解瘤背石磺肌肉工艺参数,以温度、p H、时间和液固比为试验因子,以水解度为响应值,在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken中心组合设计试验原理,采用4因素3水平的响应面试验设计确定最佳工艺条件。结果表明,最佳酶解工艺参数为温度35℃,p H 1.5,时间2 h,液固比93 m L·g-1。经过验证,实际水解度为11.38%,与理论值的RSD为0.26%。     

瘤背石磺的胚胎和幼虫发育

在水温27～29℃、气温27～31℃和海水盐度为16的环境条件下人工孵化瘤背石磺的卵块,根据早期发育的形态变化将其划分为胚胎发育(包括卵裂期、囊胚期、原肠期、卵内担轮幼虫、卵内面盘幼虫)和幼虫发育(包括开口期、大面盘幼虫、附着期、匍匐幼虫)两个阶段。受精卵发育至卵内担轮幼虫需要51h,胚胎发育89h后变态为卵内面盘幼虫,第7天面盘幼虫孵化出卵,直径增大1倍;第23天幼虫变态为匍匐幼虫,虫体直径为受精卵的4倍。分析认为,瘤背石磺的胚胎发育具备典型的不等全裂、螺旋卵裂特征,幼虫为典型的腹足纲面盘幼虫形态;温度对胚胎发育时间影响显著而充气可以加速幼虫孵化出卵;面盘幼虫需要有适宜的潮间带环境和饵料(如底栖硅藻)才可以正常附着变态。     

瘤背石磺的胚胎和幼虫发育

在水温27～29℃、气温27～31℃和海水盐度为16的环境条件下人工孵化瘤背石磺的卵块,根据早期发育的形态变化将其划分为胚胎发育(包括卵裂期、囊胚期、原肠期、卵内担轮幼虫、卵内面盘幼虫)和幼虫发育(包括开口期、大面盘幼虫、附着期、匍匐幼虫)两个阶段。受精卵发育至卵内担轮幼虫需要51h,胚胎发育89h后变态为卵内面盘幼虫,第7天面盘幼虫孵化出卵,直径增大1倍;第23天幼虫变态为匍匐幼虫,虫体直径为受精卵的4倍。分析认为,瘤背石磺的胚胎发育具备典型的不等全裂、螺旋卵裂特征,幼虫为典型的腹足纲面盘幼虫形态;温度对胚胎发育时间影响显著而充气可以加速幼虫孵化出卵;面盘幼虫需要有适宜的潮间带环境和饵料(如底栖硅藻)才可以正常附着变态。     

瘤背石磺磷脂酶C基因的克隆及在不同声波刺激下的表达

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)是一类与膜蛋白相关的酶,在信号转导途径中起作用。栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)能够感知当地的潮汐规律,为了探究瘤背石磺中磷脂酶C在潮汐感知中的作用和分子机制,本实验以瘤背石磺神经环为实验材料,利用RACE-PCR技术得到了其cDNA全长,并进行生物信息学分析和实时荧光定量PCR实验。结果显示,瘤背石磺PLC基因的cDNA全长为2 578 bp,开放阅读框1 881 bp, 5′非编码区337 bp, 3′非编码区340 bp,并且在末端存在AATAAA加尾信号,共编码627个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,瘤背石磺PLC氨基酸序列与福寿螺的磷脂酶C样蛋白2氨基酸序列匹配度最高,与传统形态学的分类相吻合。在实验室内模拟潮汐产生的音波来刺激瘤背石磺,使用实时荧光定量PCR检测OrPLC基因在瘤背石磺神经环中的表达,结果显示:OrPLC在刺激声波频率为40 Hz和70 Hz的时候表达量基本稳定;声波频率为160 Hz和310 Hz时表达量较低;在声波频率为220 Hz和280 Hz时,处于高表达的状态,说明该基因在瘤背石磺的低频感知中发挥重要作用。该实验为进一步了解瘤背石磺潮汐感知功能研究奠定了理论支撑。     

四种饵料对瘤背石磺生殖性能的影响

比较了螺旋藻粉(A组)、玉米粉(B组)、面粉(C组)和发酵猪粪(D组)四种饵料对成体瘤背石磺摄食、成活、产卵量和卵质量的影响.结果表明,(1)不同饵料对亲本的成活率无显著影响,各组成活率均在90%以上,面粉对亲本瘤背石磺具有较好的诱食性,发酵猪粪组的瘤背石磺摄食量较小;(2)B、C两组亲本的产卵总量明显大于A、D两组,其平均产卵量分别为每只亲本7.27×104个和6.79×104个,A、D两组亲本的平均产卵量仅为B、C两组的70%左右.B、C两组亲本的产卵高峰出现在8月26日左右,而A、D两组则出现在8月28-30日之间;(3)A组胚胎发育速度较快,孵化率达73.97%,显著高于其它三组(P＜0.05),C组孵化率次之(38.26%),D组胚胎孵化率最低(7.71%),且胚胎发育不同步,孵化时间长达19～22 d.由此可见,面粉和玉米粉有利于提高瘤背石磺亲本的产卵量,螺旋藻粉组亲本的胚胎具有较高的孵化率.     

瘤背石磺低频听力相关基因OrNXN克隆及表达分析

从瘤背石磺不同频率声音基因转录组中将有显著差异表达的基因与IMPC人类听觉感知和耳聋相关基因对比发掘出与听力相关的基因NXN。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得OrNXN基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析OrNXN在瘤背石磺不同组织、不同声音频率及不同潮汐节点的表达水平。结果显示,OrNXN基因cDNA全长为1 593 bp,开放阅读框长度为432 bp,共编码143个氨基酸,相对分子质量为15.57 ku;结构域预测分析表明,OrNXN含有Thioredoxin家族典型的硫氧还蛋白结构;多序列比对以及进化树构建结果表明,OrNXN与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明,在瘤背石磺7个组织中OrNXN在肠、神经节、性腺和腹足中均有表达,在肠中表达量最高,其次为神经节。不同声音频率刺激下,OrNXN在200和50 Hz处有差异表达,在不同潮汐节点,OrNXN表达量均不同,表达量基本与潮汐水位变化一致。研究表明,OrNXN可能在瘤背石磺参与感知潮汐节率时对潮汐发出的低频声音产生了响应。     

茶氨酸溴香酰胺对人宫颈癌细胞体内外生长的抑制作用

将茶氨酸为母体合成的茶氨酸衍生物茶氨酸溴香酰胺(TBrC)与茶氨酸作比较,评估茶氨酸溴香酰胺对人宫颈癌细胞体内外生长的抑制作用与其分子机制。应用MTT等方法检测不同浓度的TBrC对人宫颈癌细胞体外生长的影响,运用蛋白质印迹法检测解析这些人宫颈癌细胞中与凋亡和生长密切相关蛋白的表达和药物可能的作用靶点。此外,通过建立动物肿瘤模型,评价TBrC对荷瘤裸鼠人宫颈癌生长的抑制效果。实验结果显示,TBrC抑制人宫颈癌细胞体内外生长的活性超过其母体化合物茶氨酸多倍,对小鼠生长无明显毒性;TBrC作用的分子机制之一可能与抑制VEGFR1-Bcl-2/Bax信号传导通路相关。研究结果提示,TBrC具有广泛应用于临床治疗和(或)辅助治疗人宫颈癌和其他癌症的潜力。     

泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒的体外抑制作用研究

为分析泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的体外抑制作用,本研究使用CCK-8法检测泽漆水提取物对非洲绿猴肾细胞(Vero CCL-81)增殖活力的影响,通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR方法检测泽漆水提取物对PEDV的抑制作用和时间依赖关系。以广谱抗病毒药利巴韦林(Ribavirin)为阳性对照药物,探究泽漆水提取物对PEDV生命周期各个阶段的影响。结果表明:1)泽漆水提取物浓度≤500 μg/mL时在12、24 和36 h细胞无毒性。2)泽漆水提取物以剂量依赖方式显著降低PEDV-N mRNA的表达量及PEDV 病毒滴度。3)泽漆水提取物可长时间有效抑制PEDV-N蛋白的表达,预防给药对PEDV-N蛋白表达无明显抑制效果。4)泽漆水提取物在病毒复制周期的吸附及复制增殖阶段对PEDV-N蛋白的表达具有显著抑制作用,在入侵阶段对PEDV-N蛋白的表达无明显抑制效果。综上,泽漆水提取物在体外对PEDV具有显著抑制作用,主要作用于PEDV生命周期的吸附和复制增殖阶段。本研究为深入挖掘泽漆抗病毒优势奠定了基础。     

纳他霉素纳米乳的制备及其体外抑菌效果研究

【目的】制备纳他霉素纳米乳(NATA-NE),测定其对白色念珠菌（Candida albicans）、青霉菌（Penicillium）和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）,以指导临床合理用药。【方法】综合纳米乳和纳他霉素的优势,将纳他霉素制成水包油型NATA-NE,以酮康唑和特比萘芬作为阳性药物对照,根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）制定的真菌体外药敏试验方法M27A和M-38P,测定药物对3种受试菌株的MIC,并研究了NATA-NE的杀菌效果。【结果】NATA-NE对青霉菌、白色念珠菌和酿酒酵母菌的MIC值为1,0.5,0.5 μg/mL;NATA原料药、酮康唑和特比萘芬对上述3种菌的MIC值分别为2,1,1 μg/mL;4,8,8 μg/mL和1,8,16 μg/mL,NATA-NE的MIC值均小于或等于其他3种药物。3种菌在2 μg/mL NATANE的作用下1.5 h后,均未见生长;NATA原料药则需要4 μg/mL、2 h才能达到同样效果,而酮康唑和特比萘芬分别需要16 μg/mL、4 h和32 μg/mL、4 h才能达到同样效果。【结论】临床使用NATA-NE治疗动物真菌病时,可适当降低给药剂量和用药次数,以降低成本和对动物不可预期的副作用。     

红景天甙体外诱导人肝癌QGY-7703细胞凋亡研究

【目的】探讨红景天甙(Salidroside)体外诱导人肝癌QGY-7703细胞凋亡的作用及其可能的机制。【方法】-以体外培养的人肝癌QGY-7703细胞作为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测红景天甙对QGY-7703细胞生长的抑制作用,采用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光双染、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术,分析红景天甙对QGY-7703细胞凋亡的诱导作用;采用Western blot免疫印迹法探讨红景天甙诱导QGY-7703细胞凋亡的可能机制。【结果】-MTT比色法试验结果表明,0.01,0.1,1,10和100 μg/mL红景天甙对QGY-7703细胞生长均有不同程度的抑制作用,细胞生长抑制率分别为13.2%,21.9%,31.4%,46.8%和60.9%,半数抑制质量浓度(IC₅₀)为18.56 μg/mL;用10 μg/mL 红景天甙处理QGY-7703细胞48 h,AO/EB荧光双染后,可观察到个别QGY7703细胞呈现亮绿色或橘红色,表明细胞发生了凋亡;琼脂糖凝胶电泳结果显示,10 μg/mL红景天甙作用QGY-7703细胞24,48 和72 h均可导致细胞核内DNA产生有序断裂,形成DNA梯形带;流式细胞术试验结果表明,10 μg/mL红景天甙的加入量为100 和200 μL时,QGY-7703细胞凋亡数分别为178和331个,相应的凋亡率分别为1.8%和3.5%,阴性对照组（10 μg/mL红景天甙加入量为0 μL）凋亡细胞数为105个,凋亡率仅为1.1％;Western blot免疫印迹分析结果表明,红景天甙下调了Bcl-2和PCNA蛋白的表达量,而使凋亡活化基因Bax与肿瘤抑制基因p53的蛋白表达量增高。【结论】 红景天甙对体外培养的QGY-7703细胞具有明显的生长抑制作用和诱导凋亡作用,其诱导凋亡作用与Bcl-2家族成员、p53、Bax和PCNA基因调控有关。     

嗜酸乳杆菌体外黏附山羊子宫内膜上皮细胞条件的优化

[目的]优化嗜酸乳杆菌对永生化山羊子宫内膜上皮细胞体外黏附的条件.[方法]通过革兰氏染色法,研究山羊子宫内膜上皮细胞的生长状态,嗜酸乳杆菌菌液浓度、菌体生长状态和pH值以及孵育时间对菌体黏附性能的影响.[结果]当山羊子宫内膜上皮细胞培养48 h,嗜酸乳杆菌菌液浓度为1.0×109mL-1,pH值为4.0,孵育时间120...     

小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的一种简单有效方法

【目的】探讨一种简单有效的小鼠EG(Embryonic germ cells,EG)细胞体外分化为神经细胞的方法。【方法】将昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上培养3~4周,使EG细胞在高密度条件下向神经细胞分化,研究不同浓度维甲酸(Retinoic acid,RA)对EG细胞分化的诱导效果。【结果】小鼠EG细胞在高密度培养条件下向神经细胞分化,可获得较高比例的神经细胞样克隆,nestin染色阳性率达62.9%;经检测EG细胞分化产生的神经细胞样克隆外层细胞,以及从克隆中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin;在相同RA浓度下,随着EG细胞分化时间的延长,TH+(tyrosine hydroxylase,TH)神经细胞的比例增加;而在不同RA浓度下,随着RA浓度的升高,TH+神经细胞的比例呈增加趋势,经RA诱导14 d,最高可获得(2.3±0.2)%的TH+神经细胞。【结论】昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上高密度培养条件下,能自发分化为神经细胞,RA诱导可显著提高分化细胞群体中TH+神经元细胞的比例。试验建立的这种简单有效方法可用于EG细胞体外分化为神经细胞。     

精原干细胞体外分离培养的研究进展

为探索提高精原干细胞分离和体外培养效率的技术方法,以建立长期稳定的动物精原干细胞培养体系,对动物精原干细胞的分离纯化和体外培养的研究进展进行综述。以"Spermatogonial stem cell,Isolation,Culture,Enrichment,in vitro"和"精原干细胞、分离、培养和体外扩增"为检索词,查阅精原干细胞相关文献,并进行归纳整理。精原干细胞分离主要有机械分离法和酶消化法,纯化精原干细胞的方法有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞法等,目前大动物精原干细胞的富集常使用酶消化法、差速贴壁法和Percoll梯度离心法相结合。精原干细胞体外培养需模拟体内生境,通常在基础培养基中添加血清、饲养层细胞和各类生长因子等,培养条件会影响精原干细胞培养的效果。小鼠精原干细胞已建立较完善的培养体系,而人和多数大动物还缺乏完善的精原干细胞体外培养体系。