注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究

对三角帆蚌有核珍珠培育方法作了研究。珍珠囊体外培育采用胰蛋白酶对外套膜组织块进行解离，收集细胞悬液于珠核上培养珍珠囊，然后将体外形成的有核珍珠囊再者插核，并将酶解处理后的细胞悬液注射到所插核部位。结果表明，外套膜组织细胞悬液贴核生长正常，并且能够培育出体外珍珠囊；将体外珍珠囊插到母蚌外套膜内，同时注射外套膜组织细胞悬液，经60天养殖后，可以看到在珠核外面已有珍珠层开始沉积。     

三角帆蚌外套膜细胞培养的改进与大型有核珍珠的培育研究

为得到大颗粒优质的淡水有核珍珠,进行了游离细胞植入法在三角帆蚌(〖WTBX〗Hyriopsis cumingii〖WTBZ〗)内脏团插核育珠的研究。实验采用两种培养基(培养基1、2)进行外套膜外膜细胞的培养,对不同培养时间(2、4、6、12 h)的细胞活力进行检测,同时将处理过的珠核分别置于两组细胞悬液中共培养,6 h后采用内脏团插核手术,对500只三角帆蚌进行插核,并进行为期5个月的淡水有核珍珠生产实验。实验结果表明：细胞活力随培养时间逐渐增大,培养到6、12 h时,两种培养基中的细胞活力较2、4 h时均有显著提高(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.05),6 h与12 h相比差异不显著(〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05);细胞在两种培养基中分别培养,在培养2 h时两组间细胞活力没有显著差异(〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05),而在培养4、6、12 h时培养基2组的细胞活力显著高于培养基1组(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.05);培养基2组培养的细胞孵育珠核6 h后,贴附的细胞数量明显增多且分布均匀,插核5个月后,形成了包裹完整、具有光泽、沉积0.8 mm珍珠质的大型珍珠,而采用培养基1组培养的外套膜细胞进行珠核孵育而后插核,得到的素珠较多,且没有形成完整珍珠质包被的珍珠。实验表明改进后的培养基有利于三角帆蚌外套膜细胞培养,从而有利于内脏团有核珍珠的培育,这为进一步开展淡水贝类细胞培养的研究提供了实践基础,为大型有核珍珠的培育提供了依据。     

三角帆蚌外套膜细胞培养的改进与大型有核珍珠的培育研究

为得到大颗粒优质的淡水有核珍珠,进行了游离细胞植入法在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)内脏团插核育珠的研究。实验采用两种培养基(培养基1、2)进行外套膜外膜细胞的培养,对不同培养时间(2、4、6、12 h)的细胞活力进行检测,同时将处理过的珠核分别置于两组细胞悬液中共培养,6 h后采用内脏团插核手术,对500只三角帆蚌进行插核,并进行为期5个月的淡水有核珍珠生产实验。实验结果表明:细胞活力随培养时间逐渐增大,培养到6、12 h时,两种培养基中的细胞活力较2、4 h时均有显著提高(P<0.05),6 h与12 h相比差异不显著(P>0.05);细胞在两种培养基中分别培养,在培养2 h时两组间细胞活力没有显著差异(P>0.05),而在培养4、6、12 h时培养基2组的细胞活力显著高于培养基1组(P<0.05);培养基2组培养的细胞孵育珠核6 h后,贴附的细胞数量明显增多且分布均匀,插核5个月后,形成了包裹完整、具有光泽、沉积0.8 mm珍珠质的大型珍珠,而采用培养基1组培养的外套膜细胞进行珠核孵育而后插核,得到的素珠较多,且没有形成完整珍珠质包被的珍珠。实验表明改进后的培养基有利于三角帆蚌外套膜细...     

三角帆蚌所育不同颜色珍珠及其相关组织金属元素种类和含量差异分析

为研究Mn、Mg、Fe、Cu、Zn、Co这6种金属元素对珍珠颜色的影响,选用产自同一养殖池塘的三角帆蚌,比较分析这6种金属元素在内壳色为深紫色、浅紫色和白色的三角帆蚌中分别培育的紫色和白色珍珠中的含量差异,并分析金属元素含量与珍珠L,a,b颜色参数的相关性。结果显示:Mn、Mg、Fe、Co 4种金属元素在深紫色珍珠中均呈现最高含量,在白色珍珠中未检出Fe; Cu除了在三角帆蚌内壳色为浅紫色的珍珠中稍有体现之外,其余组均未检出;Zn在所有颜色珍珠中均未检测出。通过金属元素含量与珍珠颜色参数相关性分析发现,在各颜色育珠蚌组中,所育珍珠的Fe含量均与dE值呈正相关(R~20.83),Mg含量均与L值呈负相关(R~20.80),Mn含量则均与a值呈正相关(R~20.64),仅在深色蚌组中发现,所育珍珠的Co含量与L值的负相关性最高(R~20.94)。进一步比较分析了深紫色、浅紫色和白色三角帆蚌不同部位外套膜以及间液的金属元素含量,深紫色蚌组不同位点外套膜Fe含量存在显著性差异(P0.05),1号位点含量最高;不同壳色蚌的2号位点外套膜Mn、Co含量存在显著性差异(P0.05),其中白色蚌Mn含量显著高于其他两组,深紫色蚌Co含量显著高于其他两组。在白色蚌组的间液中,Mg含量存在显著性差异(P0.05)。综上所述,淡水紫色珍珠的颜色深浅与Fe、Mg、Co、Mn含量存在相关性。     

不同年龄三角帆蚌新生长性状臀角放射肋长与其他生长性状相关性和通径分析

贝类养殖和育种实践中,贝壳生长纹宽窄是衡量贝类生长速度的重要观测指标,臀角放射肋为呈现生长纹最宽的部位,为了探究臀角放射肋长作为典型生长性状的可行性,本研究分析了1~3龄三角帆蚌臀角放射肋长(X1)与壳长(X2)、壳高(X3)、全高(X4)、壳宽(X5)、活体质量(Y1)、软体质量(Y2)、壳质量(Y3)的相关性,并进行体尺性状对体质量性状(活体质量、软体质量和壳质量)的通径分析。相关性分析结果表明,1~3龄的三角帆蚌臀角放射肋长与体质量均呈极显著正相关(P<0.01)。1龄、2龄三角帆蚌壳长与活体质量的相关系数最高,而3龄三角帆蚌的臀角放射肋长与活体质量的相关性最高,且臀角放射肋长与体质量性状的相关系数均随年龄的增加呈增长趋势。通径分析和多元回归分析表明,影响1~3龄的三角帆蚌活体质量的主要因子为臀角放射肋长、壳长、壳宽,影响3龄的三角帆蚌软体质量的主要因子为壳长、壳宽,影响1龄、2龄的三角帆蚌壳质量的主要因子为壳长、壳宽,影响3龄的三角帆蚌壳质量的主要因子为臀角放射肋长、壳长、壳宽。综上所述,臀角放射肋长可与壳长、壳宽性状一起作为三角帆蚌新的典型生长性状,用以表示三角帆蚌生长速度。     

三角帆蚌免疫系统及其珍珠层研究进展

为蚌病害的防治及培育出更优质的珍珠,根据近年来淡水育珠蚌三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)及部分其他贝类的研究资料,综述了三角帆蚌血细胞免疫、体液免疫,及其珍珠层结构与形成方面的研究进展,同时分析指出了现有研究的不足及以后的研究重点。     

3个地理种群三角帆蚌育珠相关性状比较及壳重的通径分析

对3个野生三角帆蚌种群的贝壳形态及珍珠层颜色特征进行比较分析。结果表明:洞庭湖(DT)种群贝壳为短圆型,太湖(TH)种群为长扁型,而鄱阳湖(PY)种群介于两者之间;洞庭湖种群的体重指数、壳重指数、壳宽指数及壳厚指数等育珠相关性状均显著高于其他两个种群。对壳重的通径分析表明:3个群体中,壳厚对壳重的直接影响最大,壳长次之,壳高、壳宽主要通过壳厚和壳长间接影响壳重。在珍珠层边缘区域,后端出现紫色的比例均高于前端(P=0.055)。3个种群珍珠层颜色存在显著的种群特征:鄱阳湖种群中70%个体珍珠层为紫色或淡紫色,而洞庭湖和太湖种群在边缘区前端以白色为主,后端以紫色和淡紫色为主,中央区以紫色和淡紫色为主;在太湖种群中出现特征性的淡蓝色(20%);鄱阳湖种群珍珠层中出现不规则形态的金黄色斑频率最高(100%),洞庭湖种群中出现频率为45%,而太湖种群最低(15%)。综合分析认为:洞庭湖种群育珠相关性状显著优于鄱阳湖和太湖种群,其体型有利于作育珠蚌受体选育,培养大颗粒优质珍珠;太湖种群体型为长扁型,作为小片蚌可以增加小片的数量,且培育淡蓝色珍珠具有一定潜力;鄱阳湖种群珍珠层紫色特征明显,有利于紫色小片蚌品系的人工选育。研究亮点:珍珠颜色是评价珍珠品质及价值的重要指标之一。本文对三角帆蚌3个地理种群的贝壳形态特征进行了系统的比较,并首次研究了贝壳珍珠层颜色的分布特征。不同种群三角帆蚌贝壳形态、珍珠层颜色分布存在明显种群特征,鄱阳湖种群珍珠层颜色以紫色为主,太湖种群出现特征性淡蓝色。本研究结果对开展三角帆蚌珍珠单色品系,如紫色珍珠、白色珍珠或淡蓝色珍珠品系的人工选育研究具有重要参考价值。     

基于蛋白质组学的三角帆蚌珍珠囊形成相关免疫因子研究

采用iTRAQ及生物信息分析技术研究三角帆蚌珍珠囊及外套膜外膜组织蛋白组差异,筛选其与珍珠形成和生长进程中的免疫调节因子,并通过数字基因表达谱,分析了外套膜插核进程中免疫相关因子的mRNA表达水平。研究结果表明,1871个蛋白被鉴定到,其中显著性差异表达蛋白119个(P<0.05),包括上调蛋白74个,下调蛋白45个;分析发现差异表达蛋白主要具有结合、催化、结构分子、运载体、调节酶等活性,主要富集于次生代谢、变形虫病、糖酵解与糖异生、近端小管碳酸氢盐回收、心肌病、甲烷代谢、脂肪细胞因子pathway。进一步筛选获得免疫相关蛋白37个(19个上调蛋白和18个下调蛋白),其主要富集于Notch、Hippo、NF-κB、TGF-β等信号通路,参与免疫球蛋白、凋亡、损伤愈合以及炎症反应。对上调蛋白中的MRC1、LBP、EPX、FcGBP以及下调蛋白中的CD109、CNN3、NOTCH3、LAMB2等在外套膜以及插核后5、20 thd的插核组织和50、90 thd的珍珠囊组织中mRNA表达量进行分析验证,表达与蛋白水平表达趋势相同,对后续将进一步关注不同免疫相关蛋白间的相互作用及其潜在关联,为阐述贝类免疫系统调节网络研究提供基础资料。     

不同颜色珍珠层的三角帆蚌组织中类胡萝卜素含量的分析

对3～5龄(体质量为262.5～587.5 g)的三角帆蚌Hyriopsis cumingii外套膜中央膜、边缘膜、性腺、鳃丝及肝脏5种组织中的类胡萝卜素含量进行了测定,并比较了不同颜色珍珠层边缘区的个体间类胡萝卜素含量的组织差异。结果表明:三角帆蚌肝脏中类胡萝卜素含量为(134.8±61.7)mg/kg,极显著高于其它4种组织(P<0.01),依次大于性腺>边缘膜>鳃丝>中央膜,而4种组织间的含量差异均不显著(P>0.05);以边缘区珍珠层颜色为区分标准,白色个体与紫色个体的肝脏、性腺、鳃丝及中央膜组织中类胡萝卜素的含量差异不显著(P>0.05)。对同一个体珍珠层边缘区前端为白色、后端为紫色的边缘膜组织中类胡萝卜素的含量进行T检验,结果表明:同一个体中紫色区域外套膜边缘膜中类胡萝卜素的含量显著高于白色区域(P=0.01)。研究表明,肝脏是三角帆蚌类胡萝卜素转化及沉积的重要器官之一,外套膜边缘膜中类胡萝卜素含量的差异可能是引起珍珠层颜色差异的原因之一。     

不同月龄三角帆蚌幼蚌内外壳色相关性分析

供片贝内壳色显著影响所育珍珠颜色,成为珍珠贝重要遗传改良性状,但内壳色度量难度较大,严重限制了选育效率。选用4~8月龄紫色品系和白色品系三角帆蚌幼蚌为实验材料,评价三角帆蚌幼蚌内壳色与外壳色的相关性,结果表明:紫色品系三角帆蚌同时期内外壳颜色参数a^*最大相关系数为0.537(P<0.01),出现在6月龄,颜色参数b^*最大相关系数为0.724(P<0.01),出现在5月龄;紫色品系三角帆蚌5月龄外壳颜色参数a^*和4月龄外壳颜色参数b^*分别与8月龄内壳颜色参数呈现最大相关性,分别为0.414(P<0.01)和0.327(P<0.01);白色品系三角帆蚌5月龄外壳颜色参数a^*和b^*与8月龄内壳颜色参数a^*和b^*均呈现最大相关性,分别为0.424(P<0.01)和0.326(P<0.05)。综合上述结果,5月龄是通过三角帆蚌外壳色间接评价内壳色的最佳时期。揭示了三角帆蚌幼蚌外壳色与内壳色具有相关性,对指导三角帆蚌内壳色早期选育具有重要意义。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用,通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp,开放阅读框（ORF）为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程,在腮、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示,WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号,推测WNT4基因与性别决定相关。     

三角帆蚌cyclin B基因克隆及功能

通过现代分子生物学技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆了细胞周期蛋白B(cyclin B)基因的cDNA,得到长度为1 024 bp的序列信息,包括768 bp的ORF,197 bp的3′-UTR,编码255个Aa。进一步分析表明,三角帆蚌cyclin B基因与牡蛎、扇贝具有较高的相似性,其氨基酸序列中具有1个典型的周期蛋白框(cyclin-box),并存在2个周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的作用位点。通过RT-qPCR研究显示:三角帆蚌cyclin B基因在性腺中的表达最高,在雌性中的表达量显著高于雄性(P0.05);而cyclin B基因在其他组织中的表达量均显著低于性腺(P0.05),且无显著雌雄差异(P0.05);沉默cyclin B基因后,除外套膜外,其在性腺和鳃的表达显著降低(P0.05),表明RNA干扰(RNAi)对三角帆蚌不同组织具有不同的沉默效果。流式细胞仪测定RNAi后细胞的分裂时相变化,发现性腺和鳃细胞中G2/M期占比下降,表明cyclin B基因在三角帆蚌中能调控细胞分裂。初步研究了三角帆蚌cyclin B基因及其功能,为三角帆蚌细胞体外建系奠定分子基础。     

早期选择对三角帆蚌紫色选育品系幼蚌生长的影响

为了降低三角帆蚌良种选育过程中的工作量和加快选育进程,对三角帆蚌的早期选择效应进行了研究。通过对稚蚌的选择,考察了其对紫色选育品系幼蚌生长的影响。结果显示,选择组5 cm以上个体的比例达到65.20%,比对照组提高了26.80%,而4 cm以下个体下降了16.80%。通过进一步卡方检验(χ2=118.980,P0.01)表明,选择组与对照组的蚌体规格具有极显著差异。表明早期选择对三角帆蚌幼蚌的生长具有显著影响,早期选择效应显著。     

不同藻类对三角帆蚌能量代谢相关指标的影响

在水温21 ℃时,测定暴露于相同密度8种不同藻类条件下,一龄三角帆蚌对藻类的同化率、排氨率和耗氧率,实验周期为24 h。结果显示,在相同密度下,三角帆蚌对硅藻的同化率最高,为 0.660±0.003;明显高于绿藻和蓝藻（0.142±0.003和0.095±0.004）;摄食蓝藻的三角帆蚌排氨率和耗氧率最大,分别为（1.346±0.024） μg/（g·h）和（25.78±0.237） μg/（g·h）。摄食绿藻的排氨率最小,为（0.795±0.015） μg/（g·h）,摄食硅藻的耗氧率最小,为（13.307±0.127） μg/（g·h）。耗氧率与排氨率比值（O∶N）揭示三角帆蚌摄食硅藻后,其呼吸代谢底物主要以蛋白质为主;当饵料改变为蓝藻和绿藻时,O∶N比值开始明显变高,表明其呼吸代谢底物由以蛋白质为主转变为以脂肪和蛋白质为主。蓝藻和绿藻类浮游植物对三角帆蚌具有一定的胁迫效应。