不适温度条件诱导西瓜嗜酸菌进入VBNC状态的研究

由西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli)引起的瓜类果斑病,是危害西瓜和甜瓜等葫芦科作物的一种典型的种传细菌性病害.已有文章报道西瓜嗜酸菌在铜离子诱导下可进入\"有活力但不可培养\"(viable but non-culturable,VBNC)状态,并在适当条件下复苏,成为生产中潜在的病害初侵染来源.本文结合实...     

西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR_(4229)的功能研究

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR4229对fliR、fliC、hrpE和hrcN基因均为正调控。基因luxR_(4229)在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。     

西瓜枯萎病菌镰刀菌酸对西瓜苗作用机制的初步探讨

 镰刀菌酸是由镰刀菌属中那些能引起多种植物萎蔫的病原菌所产生的一种非特异性毒素,从发现至今已有60多年了,但关于它在病程中作用问题的研究还不多,而且意见也不一致。     

Bio-PCR方法检测葫芦科作物种子携带 西瓜嗜酸菌的特异性引物筛选

 由西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)引起的细菌性果斑病是一种毁灭性的种传病害,可为害多种葫芦科作物并造成重大经济损失。该病原菌为检疫性有害生物,种子带菌是田间病害发生的最重要初侵染来源,因此,种子健康检测成为病害综合防控过程中的重要环节。Bio-PCR是当前种子携带细菌检测的常用方法,而特异性引物的选择和使用是检测的关键。本研究使用已报道的7对引物对17株西瓜嗜酸菌、10株嗜酸菌属其它种的菌株和6株其它属的植物病原细菌进行了Bio-PCR检测,筛选出对西瓜嗜酸菌特异性最好的引物为SEQID4^m/SEQID5。研究表明:使用该引物对西瓜嗜酸菌MH21纯菌菌悬液的检测限度为10² CFU·mL^-1;在人工添加菌悬液的模拟带菌西瓜种子中,使用ASCM和EBBA两种半选择性培养基结合引物SEQID4^m/SEQID5进行Bio-PCR检测,ASCM对种子中带菌量的检测限度可达到0.01 CFU·g^-1,EBBA对种子中带菌量的检测限度为0.1 CFU·g^-1。     

LuxR家族调控因子 LuxR-2460 对西瓜嗜酸菌致病力及生物膜形成的调控

 LuxR家族的调控因子在革兰氏阴性细菌中起重要作用。对西瓜嗜酸菌一个LuxR家族的调控因子 LuxR-2460的调控作用进行研究。生物信息学分析表明该调控因子有2个保守结构域:N-末端为REC 结构域,C-末端为HTH 结构域。通过同源重组双交换的方法,构建了luxR-2460全基因缺失的突变株,该基因缺失突变株能够引起菌株致病力、运动能力及蹭行运动能力的下降及生物膜形成能力的增强。qRT-PCR 检测结果表明,该基因缺失导致鞭毛基因fliR在突变株中的表达量下调,影响病菌鞭毛的形成。说明luxR-2460基因对西瓜嗜酸菌的致病能力及相关因子具有重要调控作用,可以作为该病害防控的潜在靶标。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌效应蛋白AopK的功能研究

瓜类细菌性果斑病是西甜瓜产业中最重要病害之一,其病原菌西瓜噬酸菌的Ⅲ型分泌系统效应蛋白在致病过程中起重要作用。XopK为黄单胞菌效应蛋白,具有E3泛素连接酶活性,其在西瓜噬酸菌中的同源基因aopK鲜有研究。为鉴定效应蛋白AopK并探究其功能,本研究构建了西瓜噬酸菌AAC00-1菌株的aopK缺失突变株和互补菌株,发现基因aopK的缺失显著降低病原菌在西瓜幼苗上的致病力。通过AopK在本氏烟中的亚细胞定位实验,显示AopK定位于植物的细胞质膜。转录水平、外泌性及BAX共表达试验,证明aopK的表达受HrpX和HrpG正调控,其产物能够通过Ⅲ型分泌系统分泌到细胞外,并且能够抑制烟草叶片细胞中活性氧产生、胼胝质沉积以及细胞坏死产生,具有潜在抑制植物防卫反应的毒性功能。以上结果表明AopK为西瓜噬酸菌的Ⅲ型效应蛋白,研究结果为进一步探究其与寄主植物间的互作机理奠定了基础。     

西瓜噬酸菌hflX基因功能分析

为明确GTP结合蛋白基因hflX在西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli中的功能尤其是对该菌致病力的影响,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为材料获得hflX基因的缺失突变菌株及互补菌株,通过对致病力等表型以及相关基因表达量的测定初步探究西瓜噬酸菌hflX基因的功能。结果显示,同野生型菌株Aac5相比,缺失突变菌株的致病力显著下降,III型分泌系统基因hrpG和hrpE的表达量显著下调,仅为野生型菌株表达量的54.99%和27.39%;hflX基因的缺失并未影响其引起烟草过敏性坏死反应的能力;但缺失突变菌株的运动能力显著下降,鞭毛基因fliR和fliC的表达量显著下调,仅分别为野生型菌株的37.04%和29.68%。此外,缺失突变菌株的生物膜形成能力相较于野生型菌株显著增强了26.32%,同时,其体外生长能力也有所增强。表明hflX基因可能通过调控III型分泌系统基因hrpG和hrpE、鞭毛基因fliR和fliC的表达以及运动能力来影响西瓜噬酸菌Aac5菌株的致病力。     

培养条件对西瓜枯萎病菌镰刀菌酸产生的影响

 尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxysporum Sch l.f.sp.niveum(E.F.Smith) Snyder et Hansen]菌株在4种培养基(理查德培养基,Armstrong镰刀菌培养基,MS无机盐+蔗糖培养基,PDB培养液)中均能产生镰刀菌酸(Fusaric acid),理查德培养基中镰刀菌酸最高时的浓度是其它3种培养基的6~22倍。理查德培养基以C/N为5:1,葡萄糖为C源,NO-3为N源的营养条件较有利于镰刀菌酸产生。培养基初始pH值为4,通气和连续光照的培养条件最有利于菌株产生镰刀菌酸,烟酸的加入可终止镰刀菌酸产生。各培养基中孢子浓度与镰刀菌酸浓度之间呈负相关的变化趋势,培养基的pH值呈趋中(pH6~8)变化,与镰刀菌酸产生无相关性。在理查德培养基中,菌丝生长与镰刀菌酸产生之间存在平行关系。     

瓜类细菌性果斑病菌对硫酸铜的敏感性检测与分析

果斑病菌两个亚群的143个菌株继代培养10代后,通过平板画线法对各菌株的硫酸铜敏感性检测结果表明：在硫酸铜浓度为300 μg/mL(1.88 mmol/L)时只有一株菌株表现敏感,在浓度达到750 μg/mL(4.69 mmol/L)时所有菌株均表现敏感;浓度为450~650 μg/mL (2.81~4.06 mmol/L)时分离自甜瓜的敏感菌株所占比率显著低于西瓜菌株;继代培养后所有菌株的硫酸铜敏感性没有改变,证实果斑病菌具有稳定的抗铜性。     

不同发酵条件对瓜类细菌性果斑病菌感染西瓜种子的影响

西(甜)瓜果斑病是西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli侵染瓜类作物引起的典型细菌病害,种子带菌是该病最重要的传播方式,防止种子感染是病害预防的首要环节。本研究分析了西瓜种子不同发酵条件对种子感染病菌的影响。研究通过人工接种西瓜发酵液,设置发酵温度为20℃和30℃,检测在不同发酵时间下发酵液pH、A.citrulli菌量、种子外部带菌量、种子内部带菌率,以及出苗发病率,系统地分析比较发酵条件对西瓜嗜酸菌侵染种子的影响。结果表明:从开始发酵到发酵24h,发酵液中A.citrulli菌量快速增长并达到峰值1011cfu/mL,随后逐渐减少;发酵24h的种子外部带菌量最高,达到4×109 cfu/mL;发酵过程中A.citrulli可侵染种皮内部(10%)及种仁(1%);发酵温度对种子感染A.citrulli及幼苗发病率的影响不显著;此外,发酵液菌量与pH相关性显著。以上研究结果表明:控制发酵温度并不能够减少A.citrulli菌的种子感染,减少发酵时间才是减少病菌增殖感染种子的防控关键。     

西瓜噬酸菌中C-di-GMP代谢相关基因Aave_2620的功能研究

 环鸟苷二磷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是一种广泛存在于植物病原细菌中的第二信使,调控细菌多种生物学功能,从而影响病原细菌的致病性,但其在西瓜噬酸菌中的研究还未见报道。本实验以Aac5菌株为研究对象,通过构建c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620缺失突变株和互补菌株,从其致病能力及其生长能力两部分进行测定,探究此信号途径是否在西瓜噬酸菌中调控致病机制。结果表明,基因Aave_2620的缺失显著降低Aac5菌株致病力、生物膜形成能力和生长能力,减弱烟草过敏性反应以及运动能力,互补菌株表型基本得到恢复。基因Aave_2620的缺失显著影响三型分泌系统相关基因、毒性相关基因以及鞭毛及趋化性相关基因在西瓜噬酸菌中的表达量。以上结果表明c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620与西瓜噬酸菌的致病密切相关。     

哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应系统的检测

本文利用群体感应信号报告菌Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4),在LB报告平板上对燕麦食酸菌西瓜亚种的19个菌株进行了初步检测,发现18个菌株有群体感应信号产生.用琼脂条法对菌株Pslb-94进一步检测,证实菌株Pslb-94存在群体感应系统.提取了该菌株信号物质,反相薄层层析(TLC)检测证明该菌株能产生群体感应信号分子.     

基于多重PCR技术的西瓜噬酸菌分组检测方法及其应用

瓜类细菌性果斑病是瓜类作物上重要的种传细菌性病害,其病原菌西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli为我国进境植物检疫性有害生物,种子种苗带菌是病害长距离传播的重要来源,种子种苗的快速检测对病害综合防控具有重要的意义。根据寄主的差异西瓜噬酸菌分为两个组,Ⅱ组菌株比Ⅰ组菌株具有更高的铜制剂敏感性,因此,西瓜噬酸菌的分组检测可为病害田间防治中铜制剂的精准使用提供科学依据,避免化学农药的过量施用。本研究筛选了现有的西瓜噬酸菌种间特异性引物和种内分组特异引物,建立并优化了一个多重PCR体系,实现了通过一步试验,就能够准确将西瓜噬酸菌与近缘种和其他植物病原细菌区分开来,并直接鉴定到西瓜噬酸菌不同组。该多重体系可以从带菌种子浸泡液和感病植物组织研磨液中直接检测到西瓜噬酸菌的不同组,且稳定性好,具有应用于生产实践的潜力。     

瓜类果斑病菌胶体金试纸条的检测应用

瓜类果斑病是一种严重为害西甜瓜作物的细菌病害,胶体金试纸条是对其进行现场检测的主要手段.将中国检验检疫科学研究院研制的瓜类果斑病菌胶体金检测试纸条与市场上商品化的美国Agdia公司同类试纸条进行比较,发现两种试纸条的灵敏度和特异性相当,适用于检测出现疑似果斑病症状的叶片和果实;也可用于种子带菌检测,但易出现假阳性结果....