利用AFLP方法筛选中华绒螯蟹性别相关标记

利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术筛选中华绒螯蟹性别相关标记,共使用192对引物组合检测中华绒螯蟹雌、雄和雌雄混合3个基因组池的多态性,共扩增出5 376条多态性条带,平均每对引物组合扩增出28条多态性条带,获得88条雌雄差异条带。利用雌雄各10个个体再次进行AFLP验证,共62条差异条带具有性别差异,包括两种情况:(1)有49条条带在雌性的4～6个个体中存在,在雄性全部个体中缺失;(2)有13条条带在雄性4～6个个体中存在,在所有的雌性个体中缺失;其余的26条没有性别差异性。差异条带经回收、克隆、测序,结果发现有些条带包含多个序列,共得到77条DNA序列,其中31条序列与鸟类、两栖类和哺乳类等脊椎动物性染色体DNA部分片段具有同源性,相似区间在22～212 bp不等,其中6条DNA序列与命中序列之间具有生物学相关性。设计特异性的引物在基因组中检测,没有获得性别特异SCAR标记。     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348 bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

哲罗鱼AFLP技术体系建立的研究

以哲罗鱼为材料提取DNA,采用两组限制性内切酶组合酶切基因组,并对酶量、酶切时间、扩增时稀释倍数及镁离子的浓度进行优化,结果表明200 ngDNA用4 U的EcoRI和PstI在37℃酶切4 h后,再分别用4 U的Tru9I和TaqI在65℃酶切4 h后用3 U的T4连接酶连接3 h,进行预扩增,预扩增产物稀释100倍后选择扩增效果最佳,得到了清晰稳定的扩增图谱;并对两组酶切组合的扩增结果进行了比较,结果显示EcoRI、Tru9I酶切组合扩增的条带数要多于PstI、TaqI酶切组合扩增的条带数,但后者的多态性要高于前者。本研究为采用该技术对哲罗鱼基因组的研究提供了参考。     

东北红豆杉性别相关的AFLP标记研究

利用AFLP技术,运用64个引物组合,检测雌雄东北红豆杉基因组DNA的多态性,筛选与东北红豆杉性别相关的分子标记.其中7对引物组合共提供了11个与东北红豆杉性别相关的分子标记,其中10个与东北红豆杉雌性相关的分子标记,仅1个与东北红豆杉雄性相关的分子标记.     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

番木瓜性别连锁的AFLP及其SCAR标记的建立

 【目的】番木瓜（Carica papaya L.）是具有雌性、雄性和兼性性别分化,在热带和亚热带广泛种植的果树作物。番木瓜植株性别的早期确定对果园的建立具有重要意义。【方法】通过对与番木瓜性别连锁AFLP分子标记的克隆、测序和PCR引物设计,将31个与番木瓜性别连锁的AFLP分子标记转化为SCAR标记,并在具有不同性别分化的番木瓜植株和分离群体上进行验证。【结果】有16个SCAR标记在番木瓜雌性、兼性和雄性植株DNA样品上可扩增出多态性,在F2代分离群体上均与兼性性别共分离,可以有效地区分雌性株和兼性株或雄性株;另有15个SCAR标记在雌性、兼性和雄性植株DNA样品上没有扩增出多态性,不同性别DNA样品均扩增出相同大小的DNA片段。【结论】这些AFLP转化来的SCAR标记既可以作为与番木瓜性别连锁的分子标记进行早期性别分子诊断和分子标记辅助育种,又可以作为探针筛选番木瓜大片段基因组BAC文库,构建性别控制基因染色体区域的物理图谱。     

甘薯根腐病相关AFLP标记筛选

甘薯根腐病是由甘薯根腐病病原菌[ Fusarium solani(Mart.)Sacc.f.sp.batatas McClure,简称FSB]引起的一种真菌性毁灭性病害,传播途径广,蔓延速度快,近年有向长江流域以南地区传播的趋势,对甘薯生产造成极大危害.在已有的徐薯18与胜利百号F1分离群体抗性鉴定的基础上,采用分离群...     

鳜雌雄表型差异及性别相关标记筛选

为了解鳜(Siniperca chuatsi)雌雄性别表型差异,测量120日龄养殖鳜的体重及主要形态性状,雄性平均体质量(396.52±74.81)g,雌性平均体质量(442.17±54.02)g,雌性比雄性增长快10.32%;雄性头长/头高比显著大于雌性;雌性体长/体高比极显著大于雄性。通过组织学观察孵化后5～60日龄鳜性腺发育分化过程,25日龄前,性腺未分化,30日龄精巢分化,40日龄卵巢分化,精巢分化早于卵巢。利用AFLP技术筛选鳜雌雄性别相关分子标记,在4个引物组合E5M8、E1M8、E6M7、E7M3中筛选出5个雌雄差异位点,其中,E5M8-480在雄性中扩增比例为91.67%,E1M8-440和E5M8-370在雌性中比例分别为91.67%和83.33%,E6M7-280和E7M3-380为雌性特有条带。研究结果为鳜雌雄性别异形与性别鉴定提供了基础和依据。     

谷子抗锈病基因AFLP分子标记的筛选

[目的]筛选与谷子抗锈病相关的AFLP分子标记。[方法]以谷子抗锈病十里香和感锈病豫谷1号及其F2代分离群体为材料,利用AFLP技术筛选谷子抗锈病基因分子标记。[结果]在192对引物组合中,初步筛选到能够揭示抗感材料之间多态性的10对引物组合,检出率为5%。对10个抗病材料中特异条带进行回收及分析,比对结果表明,2个特异条带与玉米W22 pol基因和水稻的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因同源性分别为86%和92%;其他特异条带未发现同源的序列,可能为新基因。[结论]该研究为分子辅助育种及谷子抗锈基因克隆奠定了基础。     

利用AFLP分子标记构建杂种葱的遗传图谱

 利用大葱与野葱杂交获得的F2分离群体,通过AFLP分子标记的遗传分析,构建了包含10个连锁群,228个遗传标记的杂种葱较高密度的连锁图谱,该图谱覆盖902.6cM,平均图距为3.95cM。     

哲罗鱼人工育苗技术研究

采捕野生乌苏里江哲罗鱼(Hucho taimen Pallas)幼鱼,在流水池塘中培育至性腺成熟,进行人工繁殖和育苗技术的研究.结果表明:注射催产激素HCG、S-GnRH-A和DOM的混合制剂可促使成熟的亲鱼排卵,(9±2) ℃水温药物的效应时间在8～11 d.哲罗鱼的受精卵,为圆形、淡黄色,卵膜较软,无粘性.7 ～9 龄鱼的卵径为4.20～5.56 mm[平均(4.98±0.33) mm];吸水膨胀后的卵径为4.32～5.76 mm[平均(5.20±0.38) mm],增大约0.2 mm.6～12 kg的雌性亲鱼绝对产卵量为4 500～14 000粒/尾,相对产卵量1 000～1 200 ind/kg.哲罗鱼人工繁育的催产率、发眼率和仔鱼上浮率平均为87.5%、83.5%和86.4%.从卵受精到破膜需28～31 d[平均(29.3±1.3) d],完全出苗需38～41 d[平均(38.5±1.0) d],仔鱼上浮需56～58 d[平均(57.1±0.9) d].鱼苗驯化依次投喂水蚤→水蚤、水丝蚓→水丝蚓→水丝蚓、软颗粒饲料→软颗粒饲料→软颗粒饲料、硬颗粒饲料→硬颗粒饲料,可从动物性饵料转化为人工配合颗粒饲料喂养.人工养殖条件下,仔鱼体长与日龄的回归方程为L=1.9623e0.0219t,(R2=0.9507,n=30),稚鱼体长与日龄的回归方程为L=2.6877e0.0119t,(R2=0.9943,n=30),1龄鱼的平均体长为(16.2±0.93) cm,体重为(28.45±2.98) g.     

哲罗鱼人工育苗技术研究

采捕野生乌苏里江哲罗鱼(Hucho taimen Pallas)幼鱼,在流水池塘中培育至性腺成熟,进行人工繁殖和育苗技术的研究.结果表明:注射催产激素HCG、S-GnRH-A和DOM的混合制剂可促使成熟的亲鱼排卵,(9±2) ℃水温药物的效应时间在8～11 d.哲罗鱼的受精卵,为圆形、淡黄色,卵膜较软,无粘性.7 ～9 龄鱼的卵径为4.20～5.56 mm[平均(4.98±0.33) mm];吸水膨胀后的卵径为4.32～5.76 mm[平均(5.20±0.38) mm],增大约0.2 mm.6～12 kg的雌性亲鱼绝对产卵量为4 500～14 000粒/尾,相对产卵量1 000～1 200 ind/kg.哲罗鱼人工繁育的催产率、发眼率和仔鱼上浮率平均为87.5%、83.5%和86.4%.从卵受精到破膜需28～31 d[平均(29.3±1.3) d],完全出苗需38～41 d[平均(38.5±1.0) d],仔鱼上浮需56～58 d[平均(57.1±0.9) d].鱼苗驯化依次投喂水蚤→水蚤、水丝蚓→水丝蚓→水丝蚓、软颗粒饲料→软颗粒饲料→软颗粒饲料、硬颗粒饲料→硬颗粒饲料,可从动物性饵料转化为人工配合颗粒饲料喂养.人工养殖条件下,仔鱼体长与日龄的回归方程为L=1.9623e0.0219t,(R2=0.9507,n=30),稚鱼体长与日龄的回归方程为L=2.6877e0.0119t,(R2=0.9943,n=30),1龄鱼的平均体长为(16.2±0.93) cm,体重为(28.45±2.98) g.     

利用AFLP构建大白菜高密度遗传连锁图谱

以大白菜根肿病抗性材料CR Shinki DH系和感病性材料大白菜自交系94 SK杂交F2的138个单株作为构建遗传图谱的群体。利用AFLP技术通过45对引物筛选共获得835个AFLP标记,应用其中608个AFLP标记和6个与抗根肿病基因CRb紧密连锁的AFLP标记转化成的SCAR标记构建了一张包含556个标记位点、10个连锁群、覆盖基因组长度为795 cM的连锁图谱。该图谱中每个连锁群上的标记数在10~83个之间,平均图距在0.86~4.34 cM之间,连锁群长度在43.4~120.9 cM之间。CRb基因定位于第3连锁群9 cM的范围内。     

哲罗鲑雌性蛋白的研究

采用柱层析、蛋白质免疫印迹和电泳等方法,对哲罗鲑Hucho taimen的雌性蛋白进行了系统研究。结果表明：哲罗鲑血清和卵黄中均存在雌性蛋白,其雌性蛋白的性质相同,均为糖脂磷蛋白;与血清雌性特异蛋白一样,卵黄雌性特异蛋白的相对分子质量也为460 000,由相对分子质量分别为137 800、84 200和10 800的3个亚基组成,等电点为5.60;卵黄雌性蛋白的兔抗血清均与哲罗鲑雌性血清发生免疫反应,不与雄性血清发生免疫反应,表明这两种蛋白均具有雌性特异性;两种蛋白的抗血清可以相互检测,表明哲罗鲑雌鱼血清中雌性蛋白与卵黄中的雌性蛋白在免疫原性上和结构上具有较高的同源性。     

乌苏里江上游虎头江段哲罗鱼种群结构及生长特性

2002、2003年春、秋李对乌苏里江上游虎头江段哲罗鱼种群结构、生长特性进行了调查研究,通过对339尾样本分析,得其叉长、体重和年龄组成及生长情况：乌苏里江上游虎头江段哲罗鱼种群结构合理,种群生殖群体、补充群体较大,有利于资源的增殖和恢复。叉长与体重关系r=0．9958,生长拐点年龄t=16．5,拐点体重W=3714．71g。性成熟年龄：雌性为6^ 龄,雄性为5^ 龄,性比(9：6)为113：1。叉长、体重的相对增长率8^ 龄以下增长较大,生长比速、生长常数、生长指标与之表现出相同的规律性,表明乌苏里江上游哲罗鱼8^ 龄之前生长旺盛,以后虽然生长较8^ 龄之前减慢,但仍保持较快的生长特性。     

唇(鱼骨)基因组AFLP反应体系的建立及优化

以唇(鱼骨)为实验材料,通过对扩增片段长度多态性(AFLP)的几个关键技术参数进行研究,建立适合于唇(鱼骨)的AFLP反应体系.结果显示-通过DNA的质量、酶的浓度、酶切时间及扩增时稀释倍数等条件的调整,EcoRI、Tru9I酶切组合和PstI、TaqI酶切组合均能够获得清晰可靠的图谱,二者的结果比较显示,EcoRI、Tru9I酶切组合扩增结果的多态性要稍差于PstI、TaqI酶切组合的扩增结果,为利用AFLP标记对唇(鱼骨)基因组进行深入研究打下基础.     

3种麻醉剂对哲罗亲鱼麻醉效果的比较

为寻找哲罗(Hucho taimen,Pallas)亲鱼在标志、催产注射、挤卵(精)时安全与有效的麻醉方法,本试验比较了三氯叔丁醇、丁香油和苯氧乙醇3种麻醉剂对哲罗亲鱼的麻醉效果。试验结果显示:(1)三氯叔丁醇,入麻时间和恢复时间均较长,可达到深度麻醉期;丁香油,入麻时间短,不能达到深度麻醉期,触觉恢复快,完全恢复所需时间较长;苯氧乙醇,入麻时间短,恢复也快,可达到深度麻醉期。(2)3种不同质量分数(0.1‰,0.3‰,0.5‰)的苯氧乙醇麻醉亲鱼的恢复时间y(s)与暴露时间x(s)之间可用线性方程表示,依次为:y1=24.5x+65.9,(R2=0.990 3,60≤x≤300);y3=26.5x+82.3,(R2=0.976 1,60≤x≤300);y5=55.5x+176.0,(R2=0.999 8,60≤x≤300)。试验结果表明,在本实验中,苯氧乙醇是哲罗亲鱼进行标记、催产注射、挤卵(精)等操作的合适麻醉剂,其安全效用范围为0.1‰~0.3‰,建议最佳剂量质量分数为0.3‰。     

哲罗鲑生殖周期中血清卵黄蛋白原浓度的ELISA检测

采用柱层析、蛋白免疫印迹和电泳等方法对哲罗鲑(Hucho taimen)的卵黄脂磷蛋白进行研究,并以其鼠抗和兔抗血清为抗体建立了夹心酶联免疫反应(ELISA)对生殖周期中哲罗鲑血清卵黄蛋白原浓度的变化进行检测.结果表明,哲罗鲑卵黄脂磷蛋白分子量在460 ku,并且由3个亚基组成,分子量分别为137.8 ku、84.2 ku和10.8 ku.蛋白免疫印迹表明,卵黄脂磷蛋白抗血清与雄鱼血清无特异性反应,而与雌鱼血清有特异的反应.本研究建立的双抗体夹心ELISA检测灵敏度为7.8 ng/mL,批内变异系数为4.06%,批间变异系数为4.58%,工作范围为30～2 000 ng/mL,在该范围内标准曲线具有良好的线性和重复性.生殖周期中哲罗鲑血清卵黄蛋白原浓度由每年6月份产孵后的最低值573.4 ng/mL升高到12月份的最高值1 918.2 ng/mL,卵黄积累持续期为6个月,整个生殖周期中血清卵黄蛋白原浓度只出现一个高峰期,表明人工养殖条件下,性成熟哲罗鲑的生殖周期为1年.     

哲罗鱼胚胎和仔鱼发育的研究

用活体观察和固定观察两种方法,首次对哲罗鱼Hucho taimen胚胎和仔鱼发育进行了系统观察,描述了哲罗鱼早期发育过程.哲罗鱼受精卵为沉性端黄卵,呈圆球形,含有大量卵黄,卵色呈桔黄色,吸水膨胀后卵径为(5.55±0.15)mm.在水温为4.8～9.0℃下,受精卵历时839 h破膜,初孵仔鱼全长为(18.45±0.32)mm,卵黄囊体积为(0.074±0.009)cm3,经过60 d左右仔鱼发育基本完成.将哲罗鱼与几种鱼类进行了对比,探讨其卵径、孵化平均水温与破膜所需时间及初孵仔鱼大小之间的关系.