乳铁蛋白及其活性肽抗菌活性的研究进展

乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）是转铁蛋白家族中一种天然的铁结合糖蛋白,主要包括血清转铁蛋白和卵转铁蛋白。乳铁蛋白活性肽（Lactoferricin,Lfcin）是乳铁蛋白在胃蛋白酶作用下水解下来的由25个氨基酸残基组成的小肽。乳铁蛋白及其活性肽具有多种生物学功能,这些功能大都和它的铁离子结合特性有关。文章就近年来乳铁蛋白及其活性肽抗菌活性的研究进展作一综述。     

杂合抗菌肽Scy-Hep3在毕赤酵母中的分泌表达及其抗菌活性

为获得体外稳定表达的高抗菌活性新型抗菌肽,通过重叠延伸PCR技术获得了拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin (简记为Scy)和斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin 3 (简记为Hep3)的杂合抗菌肽基因scygonadinhepcidin3 (简记为scy-hep3),将scy-hep3与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-scy-hep3,用电转化法将其转化至毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽Scy-Hep3,并进行抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-scy-hep3,用体积分数为0. 5%的甲醇诱导表达24 h,分泌表达上清液中获得了稳定表达的相对分子质量约24 000的表达产物,与预期杂合抗菌肽Scy-Hep3的大小相符;抗菌活性结果表明,杂合抗菌肽Scy-Hep3具有广谱抗菌活性,对被测的3种革兰氏阳性菌(溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和4种革兰氏阴性菌(施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和弗氏志贺氏菌Shigella flexneri)具有较强的抗菌活性(最小抑菌浓度MIC<12μmol/L);对比于单一的抗菌肽Scy和Hep3,杂合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性显著增强。本研究结果将为杂合抗菌肽Scy-Hep3的生产和开发应用提供数据资料。     

猪源多肽类抗生素PR-39真核表达及体外活性研究

PR-39通过非穿孔形式抑制DNA和蛋白质的合成,从而对革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性。此外,在伤口修复、炎症、缺血再灌注损伤以及诱导血管生成等方面也发挥着重要的生物学功能,因此开发PR-39具有重大的意义。用人工合成的PR-39基因为模板,通过PCR扩增获得PR-39片段,将其克隆到载体pHIL-S1构建重组质粒pHIL-S1-PR-39,并电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,用MD和MM平板筛选重组子,经甲醇诱导其表达后,Tricine-SDS-PAGE分析表达蛋白,通过琼脂扩散试验检测PR-39的抑菌活性。通过MD和MM平板筛选出Mut+的转化子,甲醇诱导表达产物经Tricine-SDS-PAGE得到大约4kD的重组蛋白,并能够抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长。本研究获得了能高效稳定表达具有生物学活性的重组PR-39的基因工程菌,为抗菌肽工业化生产奠定了实验基础。     

金杯藤叶提取物的体外抗菌活性研究

[目的]对金杯藤叶的提取物进行体外抗菌活性测定及化学成分定性分析。[方法]用浓度85％乙醇作溶剂,采用微波辅助提取获得总提物,随后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取;用纸片扩散法和微孔板二倍稀释法测定总提物及各萃取相对7种常见致病茵的抑茵圈、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。用系统预试法初步测定叶提取物的化学成分。[结果]金杯藤叶总提物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌有明显抗茵作用,而对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏茵、乙型副伤寒沙门氏茵、大肠埃希氏茵等无抗茵作用;其中石油醚相和水相对3种革兰氏阳性茵有抗菌活性。金杯藤叶可能含有糖类、多糖及苷类、皂苷、有机酸、生物碱、黄酮、甾体及三萜类和强心苷类等成分。[结论]金杯藤叶的总提物含多种生物活性物质,对革兰氏阳性菌有特异性抗菌活性,且有效成分存在于石油醚相和水相。     

车前草的不同提取物抗菌活性比较研究

[目的]研究车前草不同提取物的抗菌活性,比较提取物的抗菌能力。[方法]将车前草以8种不同溶剂进行室温提取,采用分光光度比浊法测定不同提取物在96孔板中对3种细菌的抗菌活性。[结果]抗菌活性最好的是车前草无水乙醇提取物(P0.05),乙醚提取物和无水甲醇提取物次之,自来水和超纯水提取物没有抗菌活性。[结论]车前草的不同溶剂提取物均具有一定的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用最为明显,对绿脓杆菌的抑制作用也较好。     

牛乳铁蛋白素-马盖宁杂合抗菌肽的设计、合成及抑菌活性

根据抗菌肽牛乳铁蛋白素(Lfcin B)与马盖宁(Magainin)的核心功能序列,将Lfcin B(1-15)和Magainin(1-12)二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB15-MA12,采用固相化学合成法合成获得纯度大于95%的LFB15-MA12.微量肉汤稀释法测得LFB15-MA12对金黄色葡萄球菌A...     

川玄参不同溶剂萃取物的抗菌活性研究

[目的]研究川玄参不同溶剂萃取物的抗菌活性。[方法]采用滤纸片法和连续稀释法,评价川玄参不同溶剂萃取物的抗菌活性。[结果]川玄参不同溶剂萃取物对产气杆菌均没有抑制作用;石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草杆菌均有一定的抑制作用,且氯仿提取物的作用最强,正丁醇提取物和水提取物则没有抑制作用。[结论]川玄参的粗提物具有较好的抗菌活性。     

猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测

为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。     

拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为深入研究拟穴青蟹Scylla paramamosain阴离子抗菌肽SCY2的抗菌活性,将抗菌肽SCY2的成熟肽序列与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-SCY2,用电击法将其转化至毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得目的蛋白,并进行质谱鉴定和抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-SCY2,用0.5%甲醇诱导表达24 h后,分泌表达上清液中获得了相对分子质量约11 000的稳定表达产物,与预期的抗菌肽SCY2成熟肽的大小相符;纯化后的目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;抗菌活性结果表明,抗菌肽SCY2能抑制革兰氏阳性菌生长,对被测的革兰氏阴性菌无抑杀活性(>50μmol/L);抗菌肽SCY2同抗生素进行协同抗菌试验,发现SCY2与四环素协同使用对荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的抑杀存在协同作用,SCY2与青霉素协同使用对施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的抑杀具有增强作用。研究表明,较低浓度的抗生素与抗菌肽协同使用可有效地减少抗生素的使用,降低食品中抗生素的残留风险。     

人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究

对重组人溶菌酶真核表达载体的构建筛选、表达与活性鉴定,经过双酶切和测序鉴定表明,重组载体正确。电转化毕赤酵母GWDL菌株,通过G418抗性平板筛选得到高表达高效价菌株,经诱导表达,检测蛋白含量,体外抑菌检测,表达产物15 ku和预期结果一致,筛选得到效价为1 907 U/mL,编号为SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效价菌株;采用重组人溶菌酶制剂,检测样品GWDL对5种菌的最小抑菌浓度(MIC),藤黄微球菌的最小抑菌浓度较好,表明重组人溶菌酶在毕赤酵母中成功表达,活性较为稳定。     

太白蓼多糖的硫酸化修饰及其体外抑菌活性分析

建立并优选太白蓼多糖(Polygonum taipaishanease Kung polysaccharide,PTKP)硫酸化修饰的条件,探讨硫酸化修饰对太白蓼多糖抑菌活性的影响。以硫酸根取代度为指标,采用氯磺酸-吡啶法对太白蓼多糖进行修饰,以氯磺酸-吡啶比、反应时间和反应温度为因素水平,采用L9(34)正交试验对修饰条件进行优选。用氯化钡-明胶浊度法测定修饰产物的硫酸基取代度(DS),傅里叶红外变幻光谱法测其结构,微量法测定硫酸化太白蓼多糖(sulfated Polygonum taipaishanease Kung polysaccharide,sPTKP)对大肠杆菌和志贺氏菌的最小杀菌浓度。太白蓼多糖硫酸化修饰的最佳条件为氯磺酸与吡啶体积比为1∶10,反应温度为80℃,反应时间为1h,sPTKP的硫酸基取代度为1.57。红外光谱检测到S=O的伸缩振动峰。PTKP和sPTKP对大肠杆菌和志贺氏菌均有抑制作用,它们对志贺氏菌的抑制作用优于大肠杆菌。硫酸化修饰能提高太白蓼多糖对大肠杆菌和志贺氏菌的体外抑菌活性。     

抗菌肽SMAP-29基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达

[目的]对抗菌肽SMAP-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽SMAP-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连接,电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。用甲醇诱导表达构建好的重组酵母表达基因工程菌,并裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析。[结果]在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2 kD的表达带;表达产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。[结论]该研究为SMAP-29在生物医学、农业等领域中的应用奠定基础。     

石榴皮提取物抑菌活性研究进展

石榴皮是石榴的干燥果皮,多年研究表明,石榴皮具有显著的抑菌、抗癌、抗病毒,抗氧化等作用。石榴皮作为天然的抑菌剂,具有来源广泛、提取率高、副作用小、残留少、不易产生耐药性等特点,有传统的抗生素无法比拟的优势。对近年来国内外对石榴皮的抑菌成分、抑菌效果及提取方法等方面的研究进行了简要概述,以期寻找和开发一种新型高效的天然抑菌剂来替代传统的抗生素,从而为控制致病菌的传播提供理论参考,同时也为进一步扩大石榴皮在食品和医药方面的应用研究奠定基础。     

重组人溶菌酶体外抑菌活性研究

以购买商品化的溶菌酶标准品作为对照,通过平板扩散法检测重组人溶菌酶(rhLYZ)在体外对几株致病菌及益生菌的抑菌作用,同时用梯度稀释法检测重组人溶菌酶的MIC和MBC。分别将重组酶和商品酶做梯度稀释后,滴加到涂布有一定量菌液的MH平板,通过平板扩散法测量各组抑菌环直径大小,从而判定其抑菌活性。结果表明,重组人溶菌酶抑菌活性显著高于标准溶菌酶,低质量浓度的重组酶即可对致病菌的生长产生抑制和杀灭作用。rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌较为敏感,抑菌环直径达到15mm～18mm;对多杀性巴氏杆菌抑菌环直径则达到27.5mm。提示rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌及多杀性巴氏杆菌等病原菌均具有较强抑菌活性。     

牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究

为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入p ET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为390 bp,其序列与Gen Bank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体p ET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 k Da;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。     

绞股蓝总黄酮的提取工艺及抑菌性质

以陕西道地药食两用的中药材绞股蓝为研究对象,以乙醇回流提取为基础,增加溶剂浸泡的考查,通过单因素试验和Box-Behnken响应面法对绞股蓝总黄酮提取工艺进行优化。结果表明：绞股蓝总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度80.0%,提取温度59.40℃,料液比1∶10.10,浸泡时间30 min,回流时间120 min,在此条件下绞股蓝总黄酮的提取率平均值为3.80%（RSD=94.88%）,经验证,绞股蓝总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌8种测试菌均有抑制活性。     

辣椒乙醇提取液的抑菌活性研究

采用琼脂扩散法研究了辣椒乙醇提取液对细菌、霉菌和酵母菌的抑菌活性。结果表明,提取液对3种菌均具有明显的抑菌作用,且其抑菌效果随提取液浓度的增大而增强。辣椒乙醇提取液对6种供试菌株的抑菌活性依次为：酿酒酵母〉黑曲霉〉青霉〉沙门氏菌〉金黄色葡萄球菌〉枯草芽孢杆菌。     

女贞子抑菌活性研究

[目的]研究女贞子的抗菌作用。[方法]采用试管连续稀释法,测定不同稀释度女贞子水煎液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用。[结果]女贞子水煎液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）均为31 mg/ml,最低杀菌浓度（MBC）为62 mg/ml,枯草芽孢杆菌MIC为4 mg/ml,MBC为8 mg/ml。[结论]女贞子能有效地抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌,具一定的抗菌作用。     

产抑菌活性物质放线菌菌株的筛选

[目的]筛选产抑菌活性物质的放线菌菌株。[方法]以金黄色葡萄球菌、对青霉素和头孢菌素类耐药的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌,采用滤纸片扩散法对300株放线菌的发酵产物进行抗菌活性筛选,通过最小抑菌浓度法（MIC）对筛选的阳性菌株进行抗菌活性测定。[结果]筛选到抗菌活性物质产生菌111株,抑菌率为37.0%;其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和耐药金黄色葡萄球菌有抑制活性的菌株分别为111、10和47株。各菌株的最小抑菌浓度有很大差别,菌株174883对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,其发酵样品稀释到2 048倍仍然表现出抑菌活性。用青霉素酶和头孢菌素酶作用于阳性菌株发酵产物,筛选到6株菌株代谢产物的抑菌活性变弱,菌株32349和kj0428的抑菌活性被抑制最明显。[结论]筛选得到的阳性放线菌菌株具有良好的抗菌活性,为新型抗生素的筛选提供了研究基础。     

芦苇叶总黄酮抑菌及抗氧化性能研究

[目的]对芦苇叶总黄酮的抑菌性和对大豆油的抗氧化性进行研究。[方法]用液体培养法以及平板涂布培养法进行抑菌性研究,用碘量法进行POV值的测定研究总黄酮对大豆油的抗氧化作用。[结果]在总黄酮浓度为1mg/ml时,其对黑曲霉（Aspergillus niger）、大肠杆菌（E.coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的抑菌率分别为26.83%、45.78%、68.53%和84.83%。结合平板培养结果可得出对各菌种的抑制效果为：淀粉液化芽孢杆菌〉铜绿假单胞菌〉大肠杆菌〉黑曲霉。在大豆油中添加一定量的芦苇叶总黄酮提取物后,其POV值出现显著下降,但抗氧化效果低于添加等量维生素C。[结论]芦苇叶总黄酮具有较明显的抑菌和抗氧化作用,且浓度越大效果越好,该研究为芦苇的综合开发利用提供了参考。