荔枝漆酶基因LcLac 的克隆与表达分析

 为了探明荔枝漆酶基因LcLac的表达与果皮褐变之间的关系,通过筛选‘妃子笑’荔枝果皮cDNA文库和3′-RACE技术,克隆获得了荔枝LcLac全长cDNA序列（EU 527187.1）。该序列全长1 779 bp,5′-UTR长26 bp,3′-UTR长52 bp,含一个1 701 bp的完整开放阅读框,编码含566个氨基酸残基的多肽。该氨基酸残基序列与欧亚槭树等物种的漆酶蛋白相似性较高。荧光定量PCR结果表明,LcLac在荔枝花中表达量最高,果肉中表达量最低。在采后贮藏前期,随LcLac表达量上升果皮褐变指数升高,且褐变指数较高的‘妃子笑’果皮中LcLac表达量高于褐变指数低的‘紫娘喜’果皮。贮藏中后期严重褐变果皮中LcLac表达量比贮藏前期低。采后贮藏前期果皮中LcLac的上调表达可能对其褐变起促进作用。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'（Citrus sinensis Osbeck 'Cara Cara'）果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素 β-环化酶（lycopene β-cyclase,Lcyb）cDNA片段。序列分析表明,该cDNA长1654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1512 bp,可编码504个氨基酸。通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitLcyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。     

荔枝类甜蛋白基因的克隆与表达分析

以‘妃子笑’荔枝（Litchi chinenesis）为试材,通过PCR方法克隆了荔枝类甜蛋白基因LcTLP（登录号JF682821）的cDNA全长和完整开放阅读框（ORF）对应的gDNA序列。序列分析表明：该基因无内含子,cDNA序列含有一个672 bp的ORF,编码223个氨基酸残基序列。荧光定量PCR结果表明：LcTLP在花中表达量最高,其次是果皮,在果肉中表达量最低;在果实发育过程中,果皮中LcTLP表达量先上升后下降,采后果皮中的表达量高于采前,炭疽菌侵染诱导LcTLP的表达,失水和低温能抑制LcTLP的表达。     

荔枝采后果皮褐变过程中差异表达基因的SSH分析

 以‘妃子笑’荔枝果实为材料,采用抑制差减杂交（SSH）与cDNA 微阵列技术相结合,研 究了采后荔枝果皮褐变过程中的基因差异表达。分别以采后0 h 与32 h 的果皮总RNA 为驱动组与检测组, 构建了正向与反向SSH 文库,分别获得了282 个与76 个阳性克隆。通过cDNA 微阵列杂交筛选获得了在 采后32 h 果皮中上调表达克隆17 个,下调表达克隆49 个,分别代表了在采后32 h 果皮中上调表达基因 16 个和下调表达基因17 个,其中有较多的热击蛋白基因、糖代谢相关基因、细胞壁代谢相关基因等。 RT-PCR 检测基因表达结果与cDNA 微阵列杂交结果一致。     

苹果MxIrt1基因的克隆与原核表达

根据植物IRT(Iron Regulated Transporter)家族的功能保守区设计引物,通过RACE法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆得到了Fe²⁺转运蛋白基因cDNA全长,将其命名为MxIrt1(Malus xiaojinensis Iron regulated transporter 1)。将MxIrt1 cDNA片段与pET30a构建原核表达载体pEIrt,转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol·L^-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个40kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。     

砂梨果实ACC氧化酶cDNA克隆及其反义表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术从'早生新水'砂梨成熟果实cDNA中克隆出ACC氧化酶基因保守片段及其5'和3'端,拼接后获得砂梨果实ACC氧化酶cDNA全长。该cDNA全长1 225 bp,将其命名为Pyp-ACO,GenBank登录号为EF451060。Pyp-ACO核苷酸序列有一个945 bp的开放读码框,5'端非翻译区为63 bp,3'端非翻译区为217 bp,与西洋梨和苹果的编码区核苷酸序列有较高的相似性,分别为98.3%和98.1%。Pyp-ACO推导编码314个氨基酸,该序列具备非血红素二价铁离子依赖型的氧化/加氧酶类的12个保守氨基酸和催化活性所需的3个氨基酸。将Pyp-ACO编码区序列反向插入pYPX145载体,构建了由双35S启动子所控制的双元表达载体,同时已成功将表达载体导入根癌农杆菌菌株LBA4404,为耐贮藏转基因梨选育奠定了基础。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

葡萄果实成熟相关NAC转录因子的筛选、克隆及表达分析

【目的】NAC转录因子在植物生长发育中起重要调控作用。旨在筛选参与葡萄果实成熟的NAC转录因子,揭示NAC转录家族在葡萄果实成熟过程中的生物学功能。【方法】利用荧光定量PCR技术分析了NAC基因在葡萄果实不同时期的表达水平及其组织特异性,对候选基因的核苷酸序列、蛋白质性质进行分析。同时,构建pGBKT7重组质粒检测转录因子的自激活能力。【结果】红地球葡萄不同发育阶段的NAC基因表达分析中,筛选出11个差异表达的NAC基因。结合其在红巴拉多葡萄中的表达情况,确定4个NAC转录因子为候选基因。VvNAC5、VvNAC11、VvNAC13、VvNAC18基因的开放阅读框长度分别为1083、1092、1098、1062 bp,分别编码360、363、365、353个氨基酸,各蛋白分子质量与等电点不同。蛋白序列对比结果显示4个NAC基因在N端都包含高度保守的NAM结构域,但C端序列高度变异。系统进化树分析显示VvNAC5、VvNAC11、VvNAC13与众多参与组织形成和器官发育相关的NAC蛋白聚为一类,推测同时在组织形成发育过程中发挥作用;VvNAC18与众多调控果实成熟衰老及叶片脱落相关蛋白...     

脐橙果皮内裂发生的解剖结构和矿质营养元素变化

 以果皮内裂严重的和正常的枳砧‘纽荷尔’和‘卡拉卡拉’脐橙为材料,研究盛花后不同时期果皮厚度和果皮显微结构,以及果实和叶片N、P、K、Ca、Mg和S营养元素含量变化与果皮内裂的关系。结果表明,盛花后80 ~ 140 d果皮厚度下降,果皮厚度下降速率与内裂有关;盛花后80 d,两个品种内裂果园植株的果实海绵层细胞出现裂隙,盛花后140 d裂隙进一步扩大,在果皮横切面上肉眼可见裂口或小空洞,从果实外观可见陷痕;裂隙或小空洞的形成从解剖结构上可见细胞撕裂和细胞皱缩两种形式;两个品种在盛花后80、140及217 d,内裂果的果皮Ca含量均显著低于正常果,果肉Ca含量均低于正常果且多数达显著差异,N、P、K、Mg和S元素无明显变化规律;两个品种的内裂果园植株叶片Ca含量也均显著低于正常果园,而S含量显著高于正常果园,其余N、P、K和Mg元素无明显变化规律,显示Ca不足与果皮内裂有重要关系。     

磷酸二氢钾对脐橙陷痕果发生及果皮细胞壁代谢的影响

 研究‘卡拉卡拉’（Citrus sinensis Osbeck‘Cara Cara’）和‘纽荷尔’（Citrus sinensis Osbeck ‘Newhall’）脐橙果实膨大期叶面喷施钾肥（0.2% KH2PO4）后,成熟期陷痕果发生率、果皮细胞壁物质成分、细胞壁代谢相关酶活性的变化规律及其关系。结果表明,KH2PO4处理对卡拉卡拉脐橙和纽荷尔脐橙的果皮厚度、硬度及其均匀度有不同程度的影响,卡拉卡拉脐橙的陷痕果发生率显著降低。纽荷尔脐橙的细胞壁代谢以及果皮力学性能受KH2PO4的影响较小,陷痕果率无显著变化。果皮果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的降低可以减缓果皮原果胶、纤维素和半纤维素成分的降解,降低果实成熟过程中果皮软化的速度,减少陷痕果的发生。     

纽荷尔脐橙幼树对不同供磷水平的光合响应

为探索不同供磷水平对纽荷尔脐橙[Newhall navel orange(Citrus sinensis Osbeck.)]幼树光合特性的影响,给幼龄脐橙果园磷肥的合理施用量提供科学依据,以枳砧纽荷尔脐橙幼树为材料,采用土培的方法研究了不同供磷水平条件下纽荷尔脐橙幼树叶片的光合速率日变化规律;不同供磷水平与光合速率、蒸腾速率、水分利用率的关系;不同供磷水平对光合色素含量的影响。结果表明,纽荷尔脐橙Pn日变化基本规律并不因供磷水平的高低而改变。供磷水平25 mg·kg-1的条件下,叶片中Chl.a、Chl.b和Car.含量也最高,全天的Pn都维持在最高水平,这一供磷水平最有利于纽荷尔脐橙发挥光合效率。不同供磷水平与纽荷尔脐橙叶片Pn、Tr和WUE之间表现出极显著的非线性一元二次回归关系。供磷水平低于或高于25 mg·kg-1,纽荷尔脐橙幼树叶片的Pn、Tr和WUE和Chl.a、Chl.b及Car.含量都极显著地降低了;供磷水平大于45 mg·kg-1对Chl.a、Chl.b合成和Pn的抑制作用要比低于25 mg·kg-1供磷水平的强得多。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

红肉脐橙(Citrus sinensis L.)果肉中特征色素提取方法探索

红肉脐橙是目前为止惟一果肉呈粉红色或红色的脐橙,其呈色色素尚未见报道。为深入研究其果肉中特征色素的构成及在果实生长发育和贮存过程中色素含量的变化,本研究在对该色素初步定性的基础上对提取方法进行了探索。在分析红肉脐橙果肉中色素萃取液的紫外可见吸收光谱时发现,该色素有类胡萝卜素的特征吸收峰,将萃取液进行薄层层析则进一步证实其内含有番茄红素。在色素提取的前处理方式上,本研究认为冷冻干燥样品的浸提效果较真空干燥的样品稳定(变异系数小),且浸提率相差无几,所以选择冷冻干燥作为合适的样品前处理方式。色素浸提条件的正交实验结果表明,最佳浸提条件为50℃、1.5h内浸提4次,浸提的料液比为1:60。此外,浸提温度、浸提时间、浸提料液比和浸提次数对浸提率都有显著影响,影响最大的因素是浸提温度,最佳温度为50℃,随温度降低浸提率显著降低。其次是侵提时间的长短,最佳浸提时间为1.5h,延长或缩短0.5h都会使浸提率下降。浸提次数对浸提率的影响是最小的。     

纽荷尔脐橙果实发育期叶片不同形态硼含量与缺硼的关系

以‘纽荷尔’脐橙为材料,连续两年研究了缺硼和正常（对照）叶片总硼和不同形态硼含量的动态变化。结果显示：1）在果实膨大期（花后120~160 d）,越冬老叶和春梢新叶的总硼含量均有一个显著下降的过程,且大部分时间里缺硼处理的比对照硼含量低;2）缺硼树越冬老叶的自由态硼和半束缚态硼含量在果实膨大期很低,对照较高;缺硼树越冬老叶在花后120~160 d束缚态硼含量较低,相对含量较高;3）缺硼和对照树春梢新叶的自由态硼和半束缚态硼含量比越冬老叶高,束缚态硼含量较越冬老叶低;缺硼树叶片的3种形态硼含量在花后140~160 d显著低于对照,且束缚态硼相对含量较高。就‘纽荷尔’脐橙叶片不同形态硼的动态与缺硼的生理机制进行了讨论。     

纽荷尔脐橙缺硼表现与其硼、糖含量年变化的关系

 研究了赣南‘纽荷尔’和‘朋娜’脐橙果实及叶片的硼和可溶性糖含量的年变化。结果表明: 幼果期两品种果皮硼含量均较高, 之后果皮与果肉硼含量均趋下降, 但在果实膨大中后期均出现显著上升。纽荷尔越冬老叶硼含量趋明显下降并居较低水平, 而朋娜老叶硼含量变幅小且相对较高。果实膨大中后期两品种果皮和果肉的可溶性糖含量均与果实硼含量出现同步积累, 此时二者老叶和朋娜春梢叶的糖含量均出现低谷, 而对应纽荷尔春梢叶糖含量并无明显下降。     

溆浦甜橙高效离体再生研究

本研究以溆浦甜橙实生苗为试材,对影响其离体再生的各种因素进行了研究,建立了一个高效离体再生系统。结果表明,30d龄溆浦甜橙实生苗上胚轴水平置于MT＋3mg·L^-16-BA分化培养基中,不定芽的诱导率可高达83-3％,该不定芽在MT＋0．5mg·L^-1,6-BA＋1．5g·L^-1,麦芽提取物的增殖培养基上生长良好,增殖率可达96．7％,增殖系数为3.79。生根培养基以1／2MT＋0．5mg·L^-1IBA比较适宜。这一系统再生频率高,操作简便,适合于溆浦甜橙的遗传转化。     

嫁接嵌合体‘早红’脐橙果实细胞来源鉴定及其糖酸和香气物质分析

‘早红’脐橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck + C. unshiu Marc.]是来自‘罗伯逊’脐橙[C. sinensis （L.）Osbeck]和‘国庆1号’温州蜜柑（C. unshiu Marc.）的嫁接嵌合体。采用SSR和CpSSR分子标记分析了‘早红’脐橙的叶片、汁胞、囊瓣壁和白皮层的细胞来源,采用气相色谱（GC）和顶空固相微萃取-气质联用（HS–SPME–GC–MS）的方法测定了‘早红’脐橙及其两个嫁接亲本的可溶性糖和有机酸含量,以及果皮和果肉的香气物质。结果表明,‘早红’脐橙汁胞和囊瓣壁中均含有两个亲本的遗传物质,果肉中的有机酸含量显著低于两个亲本,果皮中的香气物质与‘罗伯逊’脐橙果皮基本一致,但是果肉中的香气物质与两个亲本都不尽相同。     

采用流式细胞仪分析柑橘愈伤组织的细胞周期

细胞周期分析可为研究柑橘愈伤组织理化诱变提供依据。试验以暗柳橙、长沙橘、澳洲指橘、纳维来特脐橙等4种培养多年的柑橘愈伤组织为试材,使用流式细胞仪分析其特定时间段的细胞周期,进而找到柑橘愈伤组织理化诱变的最佳时期即分裂最旺盛时期。结果表明,待测4种基因型柑橘愈伤组织在继代2周时处于分裂最旺盛时期,它们的S期时相比例分别为22.4%、21.9%、21.0%和22.9%。同时发现,待测的4种柑橘愈伤组织生长周期长短与再生能力有一定的相关性。极易再生的暗柳橙生长周期最短,易再生的长沙橘、澳洲指橘次之,丧失再生能力的纳维来特脐橙生长周期最长。