中华蜜蜂工蜂碱性磷酸酶的纯化及部分性质研究

以中华蜜蜂的工蜂成体为提酶材料,经正丁醇提取、硫酸铵分级沉淀,0.1 5%NaCl溶液透析,得粗酶液.用Sephadex G-150葡聚糖层析柱纯化粗酶,获得提纯的碱性磷酸酶,提纯倍数为16.79,比活力达到135.85 U/mg.以对硝基苯磷酸二钠(PNPP)为底物,测定提纯后的碱性磷酸酶的理化性质.结果表明:该酶的最适温度为45℃,最适pH值为8.6,米氏常数(Km值)为0.97×10-3mol/L.甲醛、甲醇、乙醇和乙二醇对碱性磷酸酶均有抑制作用.     

氨基酸对鸡肝碱性磷酸酶的影响

为了用价格低廉的材料获得纯净的碱性磷酸酶,满足生产的需要,以新鲜的鸡肝为原材料,经过0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液提取,冷乙醇/30%、60%和冷丙酮/33%、50%两次分级沉淀分离纯化,得到一定纯度的碱性磷酸酶。结果表明:鸡肝碱性磷酸酶在催化磷酸苯二钠的反应体系中,最适pH值为9.84,最适温度为40℃。在优化体系下测定12种氨基酸对鸡肝碱性磷酸酶的活性抑制相对而言,极性氨基酸对鸡肝碱性磷酸酶的抑制作用高于非极性氨基酸,带负电荷的氨基酸对鸡肝碱性磷酸酶的抑制作用高于带正电荷的氨基酸,酸性氨基酸对鸡肝碱性磷酸酶的抑制作用高于碱性氨基酸。     

细鳞鱼仔鱼肠上皮细胞刷状缘膜囊制备方法的研究

本试验以细鳞鱼仔鱼肠道为材料,通过梯度离心法时刷状缘膜进行了分离纯化.以刷状缘膜酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰胺转移酶为标志酶,以钠-钾-ATP酶代表底侧膜,琥珀酸脱氢酶指示线粒体.经两个梯度离心处理后,刷状缘膜酶得到了富积纯化.在28000 g离心处理中,碱性磷酸酶、γ-谷氨酰胺转移酶富积系数分别超过13倍和10倍,检测不到纳-钾ATP酶,琥珀酸脱氢酶仅为初始匀浆的0.01%;而43000 g处理,碱性磷酸酶、γ-谷氨酰胺转移酶富积系数也分别超过13倍和10倍,检测不到钠-钾-ATP酶和琥珀酸脱氢酶.通过刷状缘膜上相关酶类活性测定对分离结果进行了评价.结果显示,以镁为沉淀剂.对肠道匀浆以43000 g二次离心可以提高富积系数并降低污染,制作出了适用于营养吸收研究的细鳞鱼仔鱼肠道刷状缘膜囊.     

泌乳母牛血清碱性磷酸酶的含量及其与产奶量的相关分析

碱性磷酸酶为最适PH在碱性范围内(8.6～10)的磷酸单酯水解酶,能催化多种磷酸单酯水解释出无机磷,主要存在于骨、肝脏、肠粘膜中,最适PH在酸性范围的(3.4～7)称为酸性磷酸酶,在前列腺、肝脏等组织中含量很高。幼年动物。由于骨骼生长,分泌较多,故血清碱性磷酸酶活性显著高于成年。血清     

免疫鸭群中一株变异型番鸭呼肠孤病毒的分离与特性研究

本研究从广东省某发病番鸭场分离得到的呼肠孤病毒(DRV)混合有番鸭细小病毒(MDPV)疫苗株.采用MDPV阳性血清中和后,经2轮番鸭胚有限稀释克隆获得纯化的DRV.电镜观察病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径约70 nm.F6代病毒滴度为log107.5 TCID50/0.1 mL,病毒能够致番鸭胚成纤维细胞产生细胞病变,并能够致死番鸭胚和SPF鸡胚,回归1日龄雏番鸭出现典型的肝脏点状或斑块状出血等特征性病变,与临床发病鸭相同.分离株S3基因核苷酸同源性与太湖流域2011年分离株DRV-TH 11最高,为99.9％,与福建番鸭源分离株MDRV-J 18为98％;与早期MDRV在66.8 ％～67.2％之间,处于不同进化分支上.本研究分离株对番鸭胚、SPF鸡胚及雏番鸭致病力强,而且其基因序列比早期分离株变异较大,应加强监测并及时筛选新疫苗株以有效防控该病的发生和蔓延.     

大麦芽阿魏酸酯酶的分离纯化及其部分酶学性质的测定

本试验采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析对大麦芽中的阿魏酸酯酶(FAE)进行了分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果显示,分离纯化后获得了阿魏酸酯酶纯品,纯化倍数达34倍;经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,并测定其相对分子质量约为29.3 ku;最适反应温度为50℃;最适pH为5.5,但阿魏酸酯酶在60℃以下,pH 4.5~7.5之间有较好的稳定性;Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶活有很强的抑制作用,Na+和EDTA对酶有一定的激活作用。     

乳清蛋白抗菌肽的分离纯化及活性

以乳清蛋白为原料,酶解制备具有抗菌能力的生物活性肽。采用超滤、葡聚糖凝胶层析色谱、反相高效液相色谱法对酶解液进行分离纯化,并对分离产物的氨基酸组成进行分析。结果表明:葡聚糖凝胶色谱纯化最佳流速2 mL/min,最佳样品质量浓度15 mg/mL;再由反相高效液相色谱分离的高活性抗菌肽,抑菌圈直径达到31.33 mm。氨基酸分析结果显示,高活性抗菌肽碱性氨基酸和疏水性氨基酸含量最多,分别为42.69%和37.39%。     

枯草芽孢杆菌酸性内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质

将来源于藏猪粪便的枯草芽孢杆菌BY-4菌株接种于含4%麸皮的产酶培养基中,37℃、220r/min培养48h,发酵上清液经HiTrap Phenyl HP疏水作用层析、HiPrep 16/60Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化得到一个内切葡聚糖酶组分,纯化倍数为15.5,回收率为25.0%。经SDS-PAGE、酶谱分析鉴定,两步分离纯化后为电泳纯的纤维素酶,相对分子量约为55 000。酶学性质研究表明,该酶的最适反应pH为4.5,最适反应温度为60℃。Mg2+、Zn2+对该酶有一定的激活作用,而Mn2+、Co2+、Ag+对该酶产生了抑制作用。     

红景天多糖对幼鼠精原干细胞体外增殖的影响

为研究如何在体外获得更好的精原干细胞培养效果,以出生后6～8 d的小鼠为对象,应用两步酶消化法和差速贴壁法分离纯化精原干细胞.分别将浓度为100、200、300和400 ng/mL的红景天多糖加入以Sertoli细胞为饲养层的精原干细胞培养液中,以不添加红景天多糖组为对照,通过RT-PCR法和碱性磷酸酶（AP）染色鉴定细胞,MTT法研究红景天多糖对精原干细胞增殖的影响.RT-PCR和染色结果显示,分离得到的细胞为精原干细胞;MTT结果显示试验组比对照组细胞数量有显著增多（P＜0.05）,增殖率可达152％,且红景天多糖的最适添加量300 ng/mL.说明红景天多糖能显著促进小鼠精原干细胞的体外增殖.     

番鸭 (Cairina moschata ) 睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的提取及性质研究

以番鸭睾丸为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为19.18 U/mg、纯化倍数为6.46倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学。结果表明：酶的最适pH为5.6,该酶在pH3.0～7.6区域较稳定,而在pH〉7.6能很快失活;酶的最适温度为55℃。当温度为80℃时,酶完全失活。在40℃以下处理30 min,酶活力保持稳定,高于45℃,酶稳定性较差。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.215 mmol/L,最大反应速度Vm为5.54μmol/L.min。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为69.05kJ/mol。金属离子对酶的效应试验表明：高浓度的Na＋和K＋对酶有抑制作用;Mg^2＋对酶有轻度激活作用,Cu^2＋、Pb^2＋、Zn^2＋、Ca^2＋、Ba^2＋对酶活力有不同程度的抑制作用;Al3＋对酶有抑制作用。     

莆田黑猪精液中NAGase酶学特性研究

试验对以莆田黑猪精液为材料分离纯化得到的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)进行了理化特性研究。经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G100分子筛层析获得PAGE电泳纯化的NAGase酶制剂。以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-GlcNAc)为底物,研究酶催化水解的相关性质。分离纯化获得的酶制剂比活力为1561.42 U/mg,分子质量为58 ku,只有1个亚基,等电点pI为9.13。酶的最适pH为5.6,最适温度为45 ℃,酶在pH 3.6～7.8之间稳定,当pH>8时迅速失活,在50 ℃以下处理30 min酶活力保存稳定,高于50 ℃时,酶活力迅速降低。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,米氏常数K_m为0.82 mmol/L,最大反应速度V_m为39.23 μmol/(L·min)。催化pNP-GlcNAc反应的活化能为27.30 kJ/mol。金属离子中Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活力无明显影响,Zn²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺对酶有抑制作用。     

沙福芽抱杆菌G7-7碱性果胶酶纯化及酶学性质研究

通过硫酸铵盐析、Mono Q阴离子交换层析技术,对1株来自沙福芽孢杆菌G7-7所产果胶酶进行分离纯化,得到分子质量为57 kDa电泳纯的果胶酶.结果显示,发酵上清液经两步分离纯化后,活力达6.6U/mg,纯化回收率为30.3％,纯化倍数为3.7.果胶酶最适的作用温度36℃,50℃以下稳定;最适pH值9.5,pH值7～1...     

瘦肉型猪(PIC344)精液碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

用正丁醇抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE SepharoseFF和SephacrylS 200柱层系,从瘦肉型猪(PIC344)精液中提取出碱性磷酸酶。纯化倍数11 46,比活为81 23U/mg蛋白。提取液经PAGE和SDS PAGE检测,呈现一条带。该酶相对分子质量为90 12KD,亚基分子质量为48 41KD,该酶为两个相同亚基组成。等电点为8 19,最适pH值9 5,最适温度为40℃,以磷酸苯二钠为底物测得Km值为3 98×10-4mol/L。经分析,Cu2 、Cd2 为酶的抑制剂,Ni2 、Ca2 、Mg2 为该酶的激活剂。选用CuSO4、Cd(NO3)2作酶的抑制类型判断,结果表明,CuSO4为非竞争性抑制,抑制常数为1 32×10-3mol/L,Cd(NO3)2为竞争性抑制,抑制常数为3 33×10-4mol/L。     

多种碱性蛋白酶酶学性质的比较研究

试验旨在探究不同碱性蛋白酶的酶学性质差异,评估多种碱性蛋白酶在不同条件下的酶活性。结果表明,酶D的最适反应温度为50℃,其余为60℃;酶D的耐热性最好;所有酶最适反应pH值均为10.5;酶活性均受到Cu2+的显著抑制,相对酶活低于30%;酶活受化学试剂影响较小;均对胰-胃蛋白酶耐受性较差,相对酶活低于14%;Km值在3.45～33.33之间,νmax值在0.05～1.75 g/min之间。研究表明,不同来源的碱性蛋白酶有不同的酶特性。     

雏番鸭鸭疫里默氏杆菌病的病原鉴定与耐药性分析

2013年4月,安徽省某养鸭场番鸭群于6周龄时突然发病,且死亡率在50%以上。从送检病雏番鸭的肝脏、心脏、脑等病料组织中分离、纯化,获得一株细菌。经染色镜检、形态学观察、生化试验、PCR特异性检测以及动物回归试验等,结合该病的临床发病特点,确诊为雏番鸭鸭疫里默氏杆菌病。药敏试验结果显示,分离株对强力霉素、氟苯尼考、复方新诺明、环丙沙星等抗生素敏感,而对恩诺沙星、诺氟沙星、庆大霉素、青霉素等抗生素具有耐药性。     

瓜蒌纤溶酶的分离纯化及性质研究

利用亲和层析从瓜萎蛋白粗提液中分离纯化得到一纤溶酶,并对其部分酶学性质进行研究.结果表明,该酶表观分子量为66.0 kD;最适pH值为9.0;在4～40℃活性无明显变化,78℃以上完全失活;在以酪蛋白为底物的水解反应中,温度、酶底物比、pH值、反应时间4种因素对水解反应的影响力大小为:温度>酶底物比>反应时间>pH;Km值为1.89mg/mL,Vmax=555.56μmol/(L·min).     

家蚕表皮酪氨酸酶和漆酶的分离纯化及酶学鉴定

酚氧化酶是昆虫黑化反应的关键酶类。采用硫酸铵分级(20%～30%、40%～65%饱和度)沉淀以及ConA Sepharose4B亲和层析和Sephacryl S-200凝胶过滤的方法,从家蚕蛹表皮样品中分离纯化出酪氨酸酶和漆酶,2种酶的比活力分别达到2 900、1 343 U/mg。经非还原SDS-PAGE电泳和酶学动力学特性分析表明:家蚕表皮酪氨酸酶的分子质量约80 kD,酶蛋白经凝胶电泳分离后用底物酪氨酸和邻苯二酚染色呈现棕褐色条带,该酶与2种底物的米氏常数(Km)分别是16.8 mmol/L和12.5 mmol/L,最适pH分别是6.5和7.5,最适温度均是30℃;家蚕表皮漆酶的分子质量约44 kD,酶蛋白经凝胶电泳分离后用底物2,2'-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)(ABTS)染色呈现蓝绿色,而用酪氨酸染色颜色没有变化,该酶与底物ABTS的Km值是32.7 mmol/L,最适pH 5.0,最适温度50℃;酪氨酸酶的热稳定性比漆酶高。研究结果表明,采用硫酸分级沉淀、亲和层析和凝胶过滤方法能从家蚕表皮中分离纯化出漆酶和酪氨酸酶,酶学动力学分析二者对催化底物的特异性有差别,推测它们在家蚕表皮的硬化和黑化过程中发挥不同生理作用。     

一例雏番鸭新型鸭呼肠孤病毒感染的诊断

2017年1月,福建省南平市延平区某养殖户饲养的雏番鸭出现大面积死亡,死亡率约45%。死亡鸭见有角弓反张、运动失调等症状。剖检死亡雏番鸭见肝脏呈现大面积点状、片状不规则出血,且伴有坏死;脾脏见有明显的脾坏死。结合临床初步诊断为新型鸭呼肠孤病毒感染。采集病死雏番鸭的肝脏和脾脏,进行细菌分离鉴定与新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测。结果表明,死亡雏番鸭细菌分离为阴性,RT-PCR试验可以特异性扩增出约586 bp的新型鸭呼肠孤病毒特异性条带,而经典呼肠孤病毒和鸭肝炎病毒未见特异性目的条带,确诊雏番鸭感染新型鸭呼肠孤病毒。     

鸡毒支原体磷酸酶PrpC活性检测

HPr激酶/磷酸酶(PrkC/PrpC)系统在细菌和支原体中高度保守,不仅参与糖酵解酶类的磷酸化/去磷酸化,也与毒力、生物被膜等生命活动相关。克隆并突变获得编码鸡毒支原体磷酸酶PrpC的ptc1基因,经原核表达纯化后,利用底物PNPP体外检测其酶活性,并对影响该酶活性的pH、金属离子、温度等影响因子进行分析。结果表明,Ptc1蛋白具有磷酸酶活性,Mn2+为该酶辅因子,最适离子浓度为2mol/L,最适pH为8.5,最适温度为37℃。相同浓度的Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Al 3+、Hg2+等金属离子均对表达产物具有不同程度的抑制活性。初步建立了PrpC功能检测体系,为进一步深入研究PrkC/PrpC调节系统奠定基础。     

伴大豆球蛋白酶解肽抑菌活性研究

建立伴大豆球蛋白酶解产生抑菌肽的最适条件,对酶解产物进行分离纯化后进一步测定其抑菌活性。采用复合风味蛋白酶水解伴大豆球蛋白,测定不同时间的酶解液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果显示:2 h水解产生的酶解肽具有抑菌活性,其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别是2.6和3.2 mg/mL。2 h水解液经Sephadex-G15分离纯化,采用平板计数法鉴定各组分。结果显示:CP2组分对大肠杆菌具有显著的抑制作用(P<0.05)。本研究证明伴大豆球蛋白的复合风味蛋白酶酶解肽具有一定的抑菌活性。