大豆乙酰羟基酸异构还原酶基因GmAHRI的克隆与分析

基于电子克隆获得的大豆GmAHRI基因cDNA序列编码区设计特异引物,以高异亮氨酸大豆品种“和龙早熟豆”总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1764 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定.测序结果显示:GmAHRI基因家族有2个成员,分别命名为GmAHRI1( FJ594399.1)和GmAHRI2( JN...     

基于DDRT-PCR研究茶树对茶尺蠖取食诱导的基因表达谱差异

利用DDRT-PCR技术初步研究了茶树被害虫茶尺蠖取食后基因表达谱差异。结果表明：接头引物A3、A4、A6、A7和A8分别与随机引物R1-R8,R12组合扩增后,总共得到222条差异片段,占总条带数的32.8％。在所鉴定的20个差异片段中,有8个片段序列没有发现同源序列;有5个片段序列与未知功能蛋白相关;其余7个差异表达的片段序列可分为6类,即分别与光合系统II色素蛋白（C15）、非生物抗性诱导蛋白（D22）、糖苷代谢酶（A45）、核酸和蛋白转录调控因子（A12, D63）、生长素调节蛋白（E94）和营养性抗虫蛋白（D73）。其中差异表达片段C15、A45、D22、D73和E94在植物与害虫相互作用相关分子机制研究中首次被发现。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。     

番茄1-氨基环丙烷羧酸ACC合成酶基因的克隆及其反义基因表达载体的构建

从成熟番茄果实中分离mRNA，以Oligo（dT）为引物在AMV逆转录酶作用下合成ACC2cDNA第一链，以cDNA为模板通过PCR扩增ACC2基因，获得1.45kb的扩增片段，将此片段克隆到BS质粒的EcoRV位点上，对插入片段两端进行部分序列分析，随后，将此片段以反方向插入双元载体pBI151的35S启动子和NOS终止子之间，通过三条交配法将携带反义ACC2基因的中间表达载体pBA7转入根癌农杆菌LBA4404，得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473.以苎麻（Boehmeria nivea）栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5′及3′RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4.BnCesA4cDNA序列全长4008bp,其中编码区全长3270bp,编码一个含1090aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列.根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种：湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析.qRT-PCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大.     

利用mRNA差别显示技术分离橡胶树死皮病相关cDNA

从中国热带农业科学院橡胶树早期预测试验地采集不同品系的橡胶树胶乳和树皮组织，分别提取纯化mRNA 合成cDNA第一链。通过4个简并锚定引物和10个随机引物进行PCR扩增，经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了至少4个差异DNA片段只在健康树中表达而在死皮树中没有出现，这4个差异DNA片段分别命名为Hb1(725bp),Hb2,Hb3,Hb4。对Hb1进行了分离，纯化，经Northern杂交证实，Hb1在健康树胶乳中表达活跃，而在死皮树胶乳中表达受到强烈抑制，表明Hb1是与死皮病相关的cDNA片段，进一步将Hb1片段进行回收和克隆，并进行DNA序列分析，序列在GenBank中进行BLAST分析未发现相关同源片段，死皮病相关cDNA片段的获得，将分离全长死皮病相关基因，搞清该基因表达调控的机理提供条件，进而为从分子水平上阐明死皮病的致病机理打下了基础。     

植物甜蛋白MabinlinⅡB亚基cDNA的克隆与序列分析

依据MabinlinⅡB亚基N端与C端氨基酸序列设计两个简并引物。从马槟榔（CapparismasaikaiLevl．）种子中提取总RNA。经反转录合成cDNA第一链,以此为模板进行多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）产物为近22bp的DNA片段。经克隆及序列测定结果表明,该片段为MabinlinⅡB亚基cDNA的185bp。     

低温胁迫下茶树基因表达的差异分析

利用cDNA-AFLP技术分析了茶树在低温胁迫下的基因表达差异。用16对引物(256个组合)对三个样品池进行了差异条带的筛选,结果表明,在冷胁迫不同处理时期相关基因表达存在显著差异,共获得了86个差异片段。在选择回收的10条差异表达cDNA片段中,经克隆测序,Blast序列同源性检索,显示其中片段1与一种低温和盐胁迫响应蛋白有77%的同源性,片段5与拟南芥冷诱导表达相关60 s ribosomal protein L7(RPL7B)有89%的同源性;片段8与一种逆境诱导蛋白(Stress-induced H1-Histone protein)有79%的同源性;片段9与干旱条件下的EST序列有着较高的同源性,其它6个片段在GenBank数据库中未找到相似序列,可能为新基因。     

大豆11S球蛋白Gy5(A3B4)cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA,逆转录形成cDNA第一条链.根据genebank中大豆11S球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物,用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列,克隆到pUC19质粒载体上,并测定其全序列.用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒,将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接,构建成植物表述载体并转化到农杆菌中,以便于以后的研究利用.     

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。     

玉米双低频酶cDNA-AFLP体系的建立

以玉米自交系QCL1094为材料,用RNAiso Reagent、柱式试剂盒法、异硫氰酸胍法等3种方法提取苗期叶片总RNA,用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录获得第一链cDNA,用RNase H、E.coli DNA聚合酶I和E.coli DNA连接酶合成第二链cDNA,用T4 DNA聚合酶进行末端平滑得到双链cDNA,最后,用双低频酶EcoR I和Pst I酶切双链cDNA,用T4 DNA连接酶连接接头,用引物EA00和P00进行预扩增,用引物EA01和P01进行选择性扩增。经1%琼脂糖凝胶和6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,RNA提取及cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增的效果良好。     

巴西橡胶树低温诱导全长cDNA文库构建

通过低温诱导处理巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)品系93-114幼嫩枝条和树叶,提取总RNA,并分离纯化mRNA.利用SMART技术合成橡胶树全长cDNA,经过Sfi I酶切后连接到pDNR-LIB载体中,得到全长cDNA文库.文库库容为1.4×106,重组率达到100%.挑取单菌落提取质粒并酶切鉴定,插入片断分布在0.3～2 kb之间,平均大小为1 kb左右,表明该文库质量合格,可用于全长基因的筛选.     

安吉白茶正常与白化叶片基因表达差异的初步研究

用mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)研究了茶树温敏突变体——安吉白茶正常叶片和白化叶片的基因表达差异。从58个差异表达的片段中通过半定量RT-PCR鉴定出12个阳性片段,其中5个片段在正常叶片中特异表达,4个在白化叶片中特异表达,1个在绿色叶片中上调表达,2个在白化叶片中上调表达。通过与GenBank BLASTX比对分析,5个基因片段比对出相似序列,分别为拟南芥的血红素结合蛋白家族中心区域基因、甜菜的甲硫氨酸合酶基因、苜蓿的一个逆转座子基因、人类20号染色体上的一段3-磷酸甘油醛脱氢酶假基因和玫瑰的ACC合成酶基因,其余7个片段未比对上同源序列,可能为新基因。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。     

低磷胁迫柱花草差异表达基因分析研究

研究柱花草在低磷条件下生长的分子机理和反应机制。采用cDNA-SRAP分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,8对引物组合共扩增出差异片段195条,其中抑制型表达片段56条,诱导型表达片段92条,上调表达型差异片段36条,下调表达型片段11条,大小均在50~1000 bp之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序,通过BLAST比对,共比对出14条差异片段的同源序列,其中8个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因（JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮还原酶、叶绿体RF2）有较高同源性,5个序列与假定基因或预测基因（UPF0051蛋白、蛋白酶启动子、SCEI结合酶、吲哚-3-丙酮酸盐单氧酶）同源性较高。本研究为筛选柱花草响应低磷胁迫的差异基因提供参考。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1 的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)对6叶期幼苗进行接种。提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cDNA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。     

利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆纯化HC-Pro病毒蛋白

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒,其辅助成分蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白,因此纯化获得具有功能活性...