草兔卵透明带蛋白2的克隆与原核表达

哺乳动物卵透明带蛋白具有极强抗原性,产生的抗卵透明带蛋白抗体可以有效阻碍精卵结合。为了探究草兔卵透明带2 (zona pellucida 2,ZP2)蛋白抗原性,以及定位抗原表位。根据GenBank上欧洲兔的卵透明带2基因序列,设计5′端磷酸化的反转录引物用于合成特异cDNA作为模板,通过普通PCR扩增草兔ZP2基因。测序获得的2 184 bp序列比对成功后,预测其信号肽和跨膜区域分别位于ZP2^35-56和ZP2^698-717。将克隆获得954 bp的hZP2基因连入pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,成功构建了重组原核表达载体pET-28a-hZP2后转化大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）BL21。重组的E.coli BL21经诱导后表达41.17 kD可溶性的hZP2融合蛋白,经优化诱导表达体系后,确定较好的诱导条件是37℃下 0.7 mmol·L^-1 IPTG诱导15 h。经Western blot鉴定,结果表明相对于表达ZP2大片段基因,hZP2融合蛋白表达量明显提高。     

Human sperm binding is mediated by the sialyl-Lewis(x) oligosaccharide on the zona pellucida

Human fertilization begins when spermatozoa bind to the extracellular matrix coating of the oocyte, known as the zona pellucida (ZP). One spermatozoan then penetrates this matrix and fuses with the egg cell, generating a zygote. Although carbohydrate sequences on the ZP have been implicated in sperm binding, the nature of the ligand was unknown. Here, ultrasensitive mass spectrometric analyses revealed that the sialyl-Lewis(x) sequence [NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc], a well-known selectin ligand, is the most abundant terminal sequence on the N- and O-glycans of human ZP. Sperm-ZP binding was largely inhibited by glycoconjugates terminated with sialyl-Lewis(x) sequences or by antibodies directed against this sequence. Thus, the sialyl-Lewis(x) sequence represents the major carbohydrate ligand for human sperm-egg binding.     

Blastocyst axis is specified independently of early cell lineage but aligns with the ZP shape

The mechanisms controlling the establishment of the embryonic-abembryonic (E-Ab) axis of the mammalian blastocyst are controversial. We used in vitro time-lapse imaging and in vivo lineage labeling to provide evidence that the E-Ab axis of the mouse blastocyst is generated independently of early cell lineage. Rather, both the boundary between two-cell blastomeres and the E-Ab axis of the blastocyst align relative to the ellipsoidal shape of the zona pellucida (ZP), an extraembryonic structure. Lack of correlation between cell lineage and the E-Ab axis can be explained by the rotation of the embryo within the ZP.     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

ETEC K99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应

目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位多肽;采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠,用ELISA法检测血清中产生的抗体,并对免疫小鼠进行了攻毒试验。结果:多肽免疫小鼠后均能诱导抗体产生,攻毒试验表明合成肽对小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

Inhibition of sperm-egg interaction by specific antibody

Treatment of hamster ova, in vitro, with ovary specific antibody interferes with sperm-egg interaction by inhibiting sperm attachment to the zona pellucida and subsequent zona penetration. This inhibition results from precipitation of the zona by the specific antibody.     

奶牛乳房炎重要候选疫苗蛋白的抗原表位分析及三联重组表位疫苗的氨基酸序列设计

为设计奶牛乳房炎三联重组表位多肽疫苗,选取奶牛乳房炎3种主要感染菌的候选疫苗蛋白:金黄色葡萄球菌的Ebps与ClfA,大肠埃希菌的OmpA与OmpC,链球菌的SIP与PGK,通过ABCpred和BepiPred方案,预测获得每种蛋白各有2个优势B细胞表位;利用神经网络与量化矩阵法预测蛋白的CTL表位。结果显示,SIP蛋白无CTL表位,其余蛋白均存在1个CTL细胞表位;采用MHC-Ⅱ类分子结合肽在线程序预测蛋白的Th表位,结果发现每种蛋白各有1个Th细胞表位。使用DNASTAR软件分析6个蛋白的二级结构,结果发现,预测获得的B/T细胞表位大多处于蛋白易于产生表位的暴露表面、无规则卷曲与转角等位置。再通过Protean程序重组拼接获得的B/T细胞抗原表位,最终设计获得抗原性较好的三联表位疫苗氨基酸序列。为新型奶牛乳房炎三联表位疫苗的研制奠定基础。     

猪O型口蹄疫病毒抗原表位/VP1蛋白的融合表达及免疫原性研究

目的 获得可稳定表达猪O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)抗原表位融合结构蛋白VP1的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1),制备亚单位疫苗。方法 设计合成含FMDV抗原表位与VP1基因序列的重组基因RP1,将其克隆到表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中,将构建的重组质粒与辅助质粒PLP1、PLP2和PLP3共转染HEK-293T细胞,获得重组慢病毒HIV-RP1;将收获的病毒液感染CHO-K1细胞,经筛选获得单克隆细胞株,通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定,获得可表达RP1的阳性细胞株,命名为CHO-K1-RP1;将CHO-K1-RP1连续传30代,每隔5代收获相同数量的细胞样品进行Western blot鉴定。结果 IFA结果显示,表达RP1的细胞发出绿色荧光,而空白对照无绿色荧光;Western blot结果显示,在约55 kU处能观察到清晰的条带;表明成功获得了融合蛋白。将获得的融合蛋白与佐剂等体积混合制备成亚单位疫苗免疫BALB/c雌鼠,抗体检测结果显示,二次免疫后,该亚单位疫苗组与口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)商品化灭活疫苗组小鼠之间抗体水平无显著差异,两者抗体水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论 本研究构建的亚单位疫苗能有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应,为猪口蹄疫新型疫苗的研制提供了参考。     

小鼠冻胚分割试验

研究了分割所用溶液、冷冻前胚胎发育时期和分割后将半胚是否装入透明带对冻胚分割效果的影响。结果证明:①将解冻囊胚分割后,无论是否将半胚装入透明带对冻胚分割的效果均无显著影响(P>0.05);②在PBS中分割解冻桑椹胚和囊胚的效果无显著差异(P>0.05);③与分割解冻桑椹胚相比,在蔗糖液中分割解冻囊胚可显著提高冻胚分割效果(P<0.05)。将在蔗糖液中分割冻囊胚获得10对半胚移植于5只受体,结果有2只妊娠,共获得半胚仔鼠6只,其中2对为同卵双生。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

一个重要的精子受体—猪透明带糖蛋白β-D-半乳糖残基

 【目的】证明末端半乳糖残基在猪透明带糖蛋白中的分布以及它在精子结合和侵入中的作用。【方法】体外成熟的猪卵母细胞去除周围卵丘细胞，用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC) 络合西非单叶豆凝集素(Bandeiraea simplicifolia lectin-I，BS-I) 或蓖麻凝集素(Ricinus communis agglutinin，RCA-I)处理30min，分别观察末端-D-半乳糖残基或-D-半乳糖残基在透明带中的定位分布。荧光显微镜观察显示，BS-I和RCA-I都标记于整个透明带上且比较集中于透明带的外层，其中BS-I显示微弱荧光反应，而RCA-I呈强荧光反应且在透明带的外层反应尤为强烈。植物凝集素处理的卵母细胞用于体外受精，分别在受精2h或12h观察精-卵结合和精子入卵情况。【结果】RCA-I处理组卵母细胞平均精子结合数显著低于对照组（18 vs 95），而精子入卵则完全被阻断；可是BS-I处理组的卵母细胞的精子结合数少量被抑制（59 vs 95），而且精子入卵率与对照组无显著差异。【结论】猪透明带末端-D-半乳糖残基作为精子受体的重要组成成分，参与精-卵结合和受精。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

猪口蹄疫病毒DNA疫苗与常规灭活苗的比较

以含有FMDV VPI基因和VPI基因主要抗原位点141—160及200—213位的氨基酸的真核表达质粒pcDNA-VPI和pcDNA-F与常规O型FMD灭活疫苗分别免疫6—8周龄的BALB／c小鼠和豚鼠,同时设生理盐水为阴性对照,以肌肉注射,间隔2周3次免疫的方式进行．通过脾脏T淋巴细胞增殖（MTT）、T淋巴细胞亚群、中和抗体、抗病毒能力的检测和病理组织学观察等方面比较DNA疫苗与常规灭活苗的免疫效果．结果发现pcDNA-VPI和pcDNA-F能够诱导细胞免疫和体液免疫反应,pcDNA-F可使小鼠和豚鼠产生一定程度的抗FMDV感染的保护性免疫,但与常规灭活苗比较还存在差异．     

猪卵母细胞透明带弹性系数—杨氏模量测定

 【目的】为了探讨猪卵母细胞的生物物理特性，该文研究了猪卵母细胞透明带的力学性质。【方法】在39℃环境下，利用微管吸吮的方法在倒置显微镜下通过显微操作装置用显微玻璃管吸吮猪卵母细胞，通过自制的专用于卵母细胞透明带杨氏模量测量软件，测量了经过44～48 h体外成熟培养的核成熟和核未成熟猪卵母细胞（n=76，共7次重复）的透明带杨氏模量。【结果】计算得到猪卵母细胞透明带的弹性模量为（1.43±0.29）×104Pa。【结论】该研究结合了生殖生物学和力学的内容，为评判哺乳动物卵母细胞和胚胎质量开拓了新的思路和内容。     

转基因植物中Bt Cry2Ab蛋白的抗原表位特征预测(英文)

[目的]通过生物信息学方法了解转基因作物中BtCry2Ab蛋白的二级结构、三级结构、B细胞抗原表位及T细胞抗原表位等结构特征,为今后的抗体设计奠定基础。[方法]以在NCBI数据库中获得Cry2Ab蛋白序列为材料,应用DNAStar中多种方法预测其B细胞表位,并通过在线预测软件NetMHCII2.2分析Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子的结合能力从而预测其T细胞抗原表位。[结果]对Cry2Ab蛋白的B细胞抗原表位的预测表明,Cry2Ab蛋白的第208～215区域是潜在的B细胞抗原表位。对Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子结合能力的分析表明,Cry2Ab蛋白的第177～185区域、299～307区域和255～263区域是潜在的T细胞抗原表位,暗示含有HLA-DRB10101和HLA-DRB10701等位基因的人群对Cry2Ab蛋白更敏感。[结论]该研究有助于深入了解Cry2Ab蛋白的生物学特征,为完善转基因食品过敏原性的评估方法提供新线索。     

转基因植物中Bt Cry2Ab蛋白的抗原表位特征预测

[目的]通过生物信息学方法了解转基因作物中Bt Cry2Ab蛋白的二级结构、三级结构、B细胞抗原表位及T细胞抗原表位等结构特征,为今后的抗体设计奠定基础。[方法]以在NCBI数据库中获得Cry2Ab蛋白序列为材料,应用DNAStar中的多种方法预测其B细胞表位,并通过在线预测软件NetMHCII 2.2分析Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子的结合能力,从而预测其T细胞抗原表位。[结果]对Cry2Ab蛋白B细胞抗原表位的预测表明,Cry2Ab蛋白的第208～215区域是潜在的B细胞抗原表位;对Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子结合能力的分析表明,Cry2Ab蛋白的第177～185区域、299～307区域和255～263区域是潜在的T细胞抗原表位,暗示含有HLA-DRB10101和HLA-DRB10701等位基因的人群对Cry2Ab蛋白更敏感。[结论]该研究有助于深入了解Cry2Ab蛋白的生物学特征,为完善转基因食品过敏原性的评估方法提供新线索。     

CD4^＋T细胞表位预测及其应用

目前,运用生物软件预测CD4^＋T细胞表位的技术越来越成熟,为表位疫苗的研究提供了有利的条件。对T细胞表位预测技术及其应用进行了综述。     

伪狂犬病病毒贵州分离株gE基因主要抗原表位区真核表达研究

收集贵州省思南县某猪场送检的哺乳仔猪病料,采用Vero细胞盲传、核酸鉴定及测序分离到1株伪狂犬病病毒贵州分离株。扩增其gE基因主要抗原表位区,构建pcDNA3．1（＋）－gE重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测基因在Vero细胞中的表达,同时将重组质粒免疫BALB／c小鼠,进行免疫学评价。结果表明：萨基因主要抗原表位区在Vero获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈特异性绿色荧光;将构建的重组真核表达质粒免疫BALB／c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。