水牛伊氏锥虫间接ELISA检测方法的建立

利用伊氏锥虫的优势变异型虫体作为可溶性抗原,通过试验研究和条件优化,建立了一种水牛伊氏锥虫间接ELISA方法.测试结果表明,该法灵敏度高,特异性强,对实验感染样本的检测获得了较好的效果,为一种有效的ELIAS方法,为广西水牛伊氏锥虫病的诊断奠定了技术基础.     

应用斑点酶联免疫吸附试验快速检测猪弓形虫抗体

将斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA)用于检测猪弓形虫抗体,并与常规ELISA和IHA法进行了比较。结果,对102份滴度下降的猪阳性血清检测,弓形虫抗体阳性检出率,Dot—ELISA为66.67％(68/102),常规ELISA为48.04％(49/102),IHA为27.45％(28/102);对675头商品猪血清检测,弓形虫抗体阳性检出率,Dot—ELISA为48.15％(325/675),常规ELISA为41.93％(283/675),IHA为33.80％(228/675);与3种寄生虫(猪囊虫、猪旋毛虫、住肉孢子虫)阳性血清无交叉反应;对123份弓形虫抗体阳性和158份阴性猪血清进行3次重复性试验,结果完全一致。结果证明,该法敏感性高,特异性强,操作简便快速(于接到病料后2h报告结果),便于在基层推广使用。     

水牛伊氏锥虫人工感染抗体规律及其广西地区自然感染状况的初步调查

通过实验感染,研究伊氏锥虫在水牛体内抗体及虫体消长的规律.ELISA检测结果表明,水牛感染伊氏锥虫后第6 d检出抗体,而且在2个多月的监测时间里,抗体都维持在较高水平(OD450nm>0.3),因此可利用ELISA方法对水牛感染伊氏锥虫进行早期诊断和监测;水牛感染伊氏锥虫后,即出现一个2～3周左右的虫血症峰期,然后虫血症峰期迅速下降,在虫血症峰期下降后1个多月的监测时间里,虫血症维持在一个很低的水平(≤1条虫体/视野),水牛感染伊氏锥虫后这种峰期短无明显症状、虫血症水平低的现象,给临床诊断和血液镜检虫体造成了一定的困难.对广西部分地区79份血清样品水牛检测的结果表明,伊氏锥虫抗体阳性率达到29.1%,说明广西各地水牛感染伊氏锥虫的现象普遍存在,而且感染率比较高,为了保证本地区水牛产业的健康发展,有必要对水牛伊氏锥虫感染进行有效的监测.     

应用斑点酶联免疫吸附试验快速检测饲料中的沙门氏菌

选用硝酸纤维素（NC）膜作固相载体，建立检测沙门氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法，检测成品饲料100份，对沙门氏菌的最低检出量为400个／mL，沙门氏菌阳性检出率43．00％（43／100），常规分离培养阳性检出率为38．00％（38／100），两者符合率为83．72％，差异不显著（P＞0．05）。试验表明该方法简便、特异、快速、结果直观，便于在基层推广使用。     

酶联免疫吸附试验检测狂犬病抗体的实际应用探讨

为探讨酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测狂犬病免疫抗体水平的应用价值,检测了深圳市10个行政区的290份犬血清,以荧光抗体病毒中和试验（FAVN）法作为金标准,分析检测结果的一致性、符合率及定量检测有效性等指标。结果显示：Kappa值为0.545,一致性评价为中度一致;总符合率为87.59%,中和效价0.51~ 2.00 IU/mL的样品出现假阴性的概率较大;相同中和效价的样品S/CO值呈多区间分布现象。建议在基层应用于免疫效果评价的实际检测时,ELISA方法可用于定性检测的初步筛查,不建议用作定量检测的方法。     

应用间接血凝试验检测水牛伊氏锥虫病抗体消长的研究

应用间接血凝试验对4头人工感染伊氏锥虫病水牛的抗体消长进行了检测,结果表明,抗体最早出现的时间为感染后3～6d,第9d达到高峰.高峰时抗体滴度为1:1280～5120.纳加诺尔治疗后,抗体滴度缓慢下降,但有波动,治疗后86～101d全部转阴.由此表明,间接血凝试验用于检测水牛伊氏锥虫病的抗体,具有早期诊断和疗效考核价值.     

斑点酶联A蛋白免疫吸附试验(Dot-PPA-ELISA)检测猪衣原体抗体方法的建立

本研究建立了斑点酶联A蛋白免疫吸附试验（Dot-PPA-ELISA）,对猪衣原体IgG的最小检测量为1.21 ng。以间接血凝试验方法为对照,两种方法同时检测120头份猪血清样品,Dot-PPA-ELISA检出43头份（35.83%）,效价≥256;间接血凝试验检出26头份（21.67%）,效价≥64。诊断膜片与猪瘟、猪布氏杆菌病、猪口蹄疫和猪弓形体病标准阳性血清均不出现有意义的交叉反应。诊断膜片置室温、4℃和-20℃下至少保存3个月其抗原效价不变。试验表明本方法重复符合率为94.44%,且反应效果不受反应板质量和新旧的影响;试剂用量节省,各步骤均可做到严格定量,操作简便,3 h内可出结果,肉眼即可判断,不需要特殊检测仪器。由于辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（PPA）是一种广谱诊断试剂,因此Dot-PPA-ELISA还可以用于其它哺乳动物衣原体抗体的检测。     

应用斑点酶联免疫吸附试验检测蛋白料精中的沙门氏菌

选用硝酸纤维素(NC)膜作固相载体,建立检测沙门氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法,检测蛋白料精50份,对沙门氏菌的最低检出量为400个/mL,沙门氏菌阳性检出率66%(33/50),常规分离培养阳性检出率为60%(30/50),两者阳性符合率为84.85%,差异不显著(P>0.05)。试验表明,该方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。     

抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（variant surface glucoprotein, VSG）免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接ELISA方法筛选,获得3D7、5B9 2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其中细胞培养上清效价分别为1∶6400和1∶12800,腹水效价分别为1∶105和1∶106。单抗的亚型鉴定结果表明,3D7、5B9分泌的抗体都为IgG1亚类κ链。     

国产咪唑苯脲对小鼠和水牛人工感染伊氏锥虫病的治疗试验

应用国产咪唑苯脲,以0.5mg、0.75mg两种剂量及1、2、3 d不同疗程,对人工感染伊氏锥虫的小鼠进行了治疗试验。结果,0.75mg×2 d组连续观察15 d以上,大多数小鼠存活,而未经治疗的对照组小鼠全部死亡。对3头人工感染伊氏锥虫的水牛,以4 mg/kg剂量一次皮下注射治疗后24 h,血液压滴标本检查虫体阴性,但1周后集虫检查和小鼠接种试验均为阳性,后改用3mg/kg×2d疗法,全部治愈。另外3头人工感染伊氏锥虫的水牛,以3mg/kg×2d疗法治疗后,用血液压滴法,集虫法及小鼠接种法检查虫体均为阴性,连续观察3个月未见复发。     

抗伊氏锥虫变异表面糖蛋白单克隆抗体的初步研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了2个抗伊氏锥虫变异表面糖蛋白的McAb。特异性实验结果表明,2个McAb只与伊氏锥虫同一变异型表面抗原发生特异反应,而不与同种异株或同株不同变异型伊氏锥虫发生交叉反应,亦不与路氏锥虫等不同种抗原反应。运用正辛酸与硫酸铵二步沉淀法纯化了腹水MeAb,纯化后的McAb活性没有明显降低。应用2个McAb,以ELISA抑制试验检测了4份伊氏锥虫血清,结果均未出现明显的抑制作用,表明血清样本间很少或完全没有与McAb相类似的抗体,进而说明伊氏锥虫存在多个血清型亦即变异抗原型。     

克隆伊氏锥虫对安锥赛抗药性的培育

为了深入观察伊氏锥虫对安锥赛抗药性的形成,将伊氏锥虫浙江水牛株克隆,克隆繁殖后的虫体一部分作为原种对照组,即C01组;一部分虫体连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,再用安锥赛亚治疗剂量治疗该小鼠,使其伊氏锥虫对安锥赛产生7个不同程度的抗药性组,即C1～C7组;另一部分虫体也连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,作为伴随C7的同步繁殖组,即不用药物的C02组.结果C01、C02、C1～C7组所用安锥赛剂量依次为0、0、6、16、40、80、196、406、638mg/kg,它们经小鼠传代数依次为0、28、1、3、6、9、15、22、28代.用体外生长繁殖抑制法测得它们的ICs0值依次为0.015 50、0.016 87、0.082 60、0.102 37、1.409 29、1.922 90、9.923 30、23.563 00、43.84000.结果表明,安锥赛亚治疗剂量与伊氏锥虫抗药性的IC50值呈曲线关系,从C1到C4的IC50值上升较缓慢,从C4后的ICs0值上升较快,并且几乎呈直线上升;伊氏锥虫所经小鼠的代数与它们的IC50值的关系呈抛物线型,从C1到C4的ICs0值上升很慢,C4以后的IC50值上升很快.用体内试验测试C01～C4组的CD100值,每个组感染35只小鼠,每只小鼠接种1.0×104条锥虫,其中30只小鼠分为安锥赛的3个剂量治疗小组,另5只小鼠为不治疗对照组.结果C01组和C1组的CD100值分别为7.0、13.0 mg/kg,这表明C1组只经1代免疫抑制小鼠,注射安锥赛剂量3×2 mg/kg,就使该组伊氏锥虫对安锥赛的抗药性提高了6 mg/kg,并且它们的IC50值C1是C01的6.6倍.C2、C3和C4组由于抗药性程度过高均不能治愈,因此尚未测到它们的CD100值.这些结果表明,伊氏锥虫经免疫抑制小鼠对安锥赛产生抗药性的速度是非常快的.     

伊氏锥虫对安锥赛抗药性机制的初步探讨

选用克隆伊氏锥虫的安锥赛敏感株 C0 1、C0 3和 5个不同程度抗药株 C1、C2、C4、C6、C7,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离它们的己糖激酶 (HK)、6 -磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6 PDH)、丙氨酸转氨酶 (AL AT)、天冬氨酸转氨酶 (ASAT)同功酶 ,并测定胆碱酯酶活性。结果 ,这 5种酶与伊氏锥虫对安锥赛产生抗药性无关。用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和测定这 7个样品的粗蛋白质 ,结果相对分子质量为 15 790带在抗药株 C1、C2、C4、C6和 C7含量较高 ,这表明它可能与安锥赛抗药性的产生有一定关系 ;相对分子质量为 1976 0带在高抗药株 C4、C6和 C7的含量很高 ,这表明它可能也与抗药性的产生有一定关系     

伊氏锥虫和布氏锥虫动基体DNA酶切电泳比较

限制性内切酶ＭｂｏＩ，ＤｄｅＩ，Ｈｉｎｆｉ和ＴａｑＩ对布氏锥虫ＫＤＮＡ进行酶切后，电泳中均显示出多条ＤＮＡ区带，其总Ｋｂ数约等于２０ｋｂ，而各限制酶对伊氏锥虫ＫＮＤＡ消化后均显示出１至２条区带，总和约１ｋｂ明显区别于布氏锥虫。     

12株中国伊氏锥虫对苏拉明的药敏试验

用体外培养生长抑制试验检测了中国伊氏锥虫安徽水牛株（AHB）、广东阳江水牛株（GDB1）、广东水牛株（GDB2）、广东马株（GDH）、广西骡株（GXM）、湖北骡株（HBM）、湖南水牛株（HNB）、江苏高邮水牛株（JSB1）、江苏盱眙水牛株（JSB2）、新疆骆驼株（XJCA）、云南水牛株（YNB）、浙江水牛株（ZJB）对苏拉明的敏感性。它们的50％生长抑制浓度（IC50）依次为0．114、0．041、0．120、0．1490．752、0．252、0．171、0．127、0．339、0．094、0．106、0．118ng/L。结果显示，不同虫株的伊氏锥虫对苏拉明的敏感性明显不同，提示中国伊氏锥虫不同虫株存在抗药性差异。在12株伊氏锥虫中，GXM株对苏拉明的抗药性水平明显高于其他株。小鼠体内治疗试验显示，GXM株以10mg/kg剂量苏拉明治疗无效，在临床上表现出一定的抗药性，而GDB1株以10mg/kg剂量苏拉明治疗则全部治愈。由此可见，体外药敏试验结果与体内治疗结果一致。这一结果提示，多数中国伊氏锥虫株对苏拉明的敏感性偏低，少数虫株已表现出一定的抗药性。     

Random Amplification of Polymorphic DNA Fingerprinting of Trypanosoma evansi

The total genomic DNAs from Trypanosoma evansi isolates of bubaline, equine and cameline origin were amplified by polymerase chain reaction using eight arbitrarily selected 10-base primers. Informative band patterns were obtained for all isolates analysed. Depending upon the T. evansi isolate–primer combination, between 1 and 11 reproducible DNA fingerprints of 205 to 3016 bp were amplified, suggesting minor and major differences in their RAPD (random amplified polymorphic DNA) profiles.