利用表达分析和基因沉默方法研究硫代硫酸硫转移酶基因TaTST与小麦抗白粉病反应的关系

硫代硫酸硫转移酶参与植物体内的硫代谢、氰化物的清除以及活性氧的生成与清除,与植物抗病反应密切相关。小麦抗、感白粉病近等基因系材料在接种白粉菌后均诱导表达硫代硫酸硫转移酶基因TaTST,并在接种后0~48 h内呈现2次诱导峰值,分别与白粉菌初次接触识别和附着胞侵入、吸器形成时间相对应,也与2次氧突发时间对应。TaTST在感病材料上的诱导表达水平明显高于在抗病材料上,由此导致的活性氧过度清除可能是导致感病反应的原因之一。TaTST也参与抗病反应过程。利用病毒诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing, VIGS)创造了TaTST基因沉默的抗病植株。尽管充分发病时间后沉默植株叶片上并未观察到肉眼可见的病斑,但侵染早期白粉菌成功侵入频率的增加和次级菌丝的有限伸长说明TaTST沉默植株抗病水平下降。TaTST沉默导致乳突致密度下降和H₂O₂在细胞内的扩散时间延迟。因此,TaTST可能通过调节活性氧的积累和扩散、乳突的形成等小麦-白粉菌互作早期的寄主细胞反应而参与小麦对白粉菌的抗侵入过程。     

白粉菌侵染Pm21近等基因系的早期蛋白组差异研究

分析接种小麦白粉菌E09后Pm21近等基因系及其亲本叶片的总蛋白质差异,从蛋白质组调控角度揭示Pm21基因抗白粉病的抗病机理。以Pm21近等基因系及其亲本百农3217为试材,显微观察接种后5 d内的叶片表面细胞与白粉菌孢子表型差异;采用非离子去污剂提取总蛋白质,运用双向电泳、质谱分析与数据库检索技术,比较Pm21近等基因系及其亲本接菌第4天后的叶片总蛋白质差异。超显微和显微观察结果表明,12 h后百农3217叶细胞表面与Pm21近等基因系相比褶皱明显;在接菌第2天后,在Pm21近等基因系白粉菌孢子生长明显慢于其亲本表面孢子,且孢子侵入个数较少,不萌发现象较多;在第4天后Pm21近等基因系被侵染叶片细胞出现过敏性反应;通过MALDI-TOF-MS/MS质谱测序和MASCOT软件序列分析,注释了15个表达上调蛋白点;功能分类表明,差异蛋白质分别参与叶绿体光合呼吸作用(40%)、放氧作用(13%)、代谢物合成(20%)、抗病、动力蛋白、运输等生理功能。蛋白质组水平发现,光合呼吸蛋白和叶谷氨酰胺合成酶在Pm21近等基因系感病3～4 h后就大量表达,可能是导致叶片明显变绿原因;叶谷氨酰胺合成酶的增加与光合呼吸蛋白的增加密不可分;光合呼吸蛋白和抗坏血酸过氧化物酶的上调表达为植物体在高H2O2浓度下正常生长提供了保障。另外,β-1,3-葡聚糖苷酶的过量表达也是Pm21基因前期抵御白粉菌侵染有效物质。钾离子通道蛋白可能在抗病防御过程中起到了信号转导的作用。     

241份小麦品种(系)白粉病抗性鉴定与分子标记检测

为了发掘更多的小麦白粉病抗性种质资源,利用我国当前白粉菌流行小种E09和E20分别对241份小麦材料进行苗期白粉病抗性鉴定,同时利用与Pm8、Pm2、Pm4a、Pm21、Pm30和Pm38基因连锁的分子标记检测其分布情况。结果表明,在供试241份小麦材料中,单抗E09、单抗E20以及兼抗E09和E20的材料分别占9.5%,20.7%和12.4%。携带抗病基因Pm38和Pm30的材料较多,分别有59份和40份,携带抗病基因Pm8、Pm21、Pm2和Pm4a的材料偏少,分别有10、2、13和10份,携带两个或两个以上抗病基因的材料很少,尤其在育成品种中更少。综合分析抗性表现与分子标记检测结果,除携带Pm21基因的2份材料对E09和E20均表现抗病外,携带其它抗病基因的材料与E09和E20的抗性没有必然的关系。     

河南小麦新育成品种(系)白粉病抗性鉴定与分子标记检测

利用华北地区流行的白粉菌菌株E09和E20,分别对河南省小麦新品种(系)区域和预备试验参试材料908份(2009—2013年度)和412份(2009—2012年度)进行苗期白粉病抗性鉴定,同时利用与Pm2、Pm4a、Pm8和Pm21基因连锁的分子标记检测相关抗病基因的分布。结果显示,抗E09的材料占21.9%(199/908),抗E20的材料占9.5%(39/412),同时抗E09和E20的材料仅占3.6%(15/412)。在908份供试材料中,580份含有1BL/1RS,占63.9%,含Pm8或新的1RS来源抗白粉病基因;另有2份材料含6AL/6VS来源广谱抗白粉病基因Pm21,8份可能携带Pm2,2份可能含有Pm4a;有6份材料可能含有多个抗白粉病基因。表明河南省近年育成的小麦新品种(系)依然含有对我国白粉菌菌系有效的抗白粉病基因,但抗源遗传基础较窄,部分已经或正在丧失抗性,应加快引进和利用新的多样化抗病基因资源。     

2013年黑龙江省小麦白粉菌毒力结构分析

2013年从黑龙江省小麦生产区分离纯化57个单袍子堆小麦白粉菌菌株,用犯份小麦白粉病菌鉴别寄主进行毒力测定。结果表明,黑龙江省不同来源小麦白粉病菌群体具有相同的毒力结构,毒性基因V7,V8,V17,V19,VT a,V3c,V3f,V3e,VSa和VI+2+9的毒性频率均达80%以上,为黑龙江省小麦白粉菌的主要毒性基因;而Pm18(Ic),Pm21,Pm2+6,Pm5+6,Pm2+MLD5个抗性基因(或基因组合)抗90%以上的菌株,为黑龙江省有效杭白粉病基因(或基因组合)。研究结果可为小麦白粉病的抗病育种及杭病品种合理布局等方面提供参考。     

小麦遗传资源抗白粉病基因的STS标记检测

从小麦中筛选抗白粉病基因,为小麦抗病育种提供抗病亲本,为育种后代抗病基因鉴定提供理论依据和技术支撑。以河北省保存的65份小麦遗传资源为材料,利用STS标记技术,对其所携带的抗白粉病基因进行检测。结果表明:检测出携带Pm21、Pm4a和csLV34抗白粉病基因的品种各一个,分别为金禾7178、河农7069和秋麦。这些资源可以作为抗病亲本在小麦抗白粉病育种中利用。     

12个小麦品种(系)白粉病抗性的遗传分析

利用17个不同来源和毒力的白粉菌菌株对12个小麦品种(系)进行苗期抗性鉴定和抗病性遗传分析,同时利用Pm2和Pm8基因的特异分子标记检测了相应基因。供试的12个品种至少能够抗11个白粉菌菌株。用E09、E20和Bg2菌株接种F₂群体,抗感植株分离比例和适合性测验证明这12个品种对不同白粉菌菌株的抗性均受1对显性基因控制。抗谱分析和基因紧密连锁分子标记(Xcfd81)分析表明良星66很可能含有Pm2或其等位基因。ω-黑麦碱基因(1RS染色体)和Glu-B1基因(1BS染色体)特异分子标记分析结果证明,山农20和郑麦9962含有T1BL·1RS易位染色体,即可能携带Pm8基因。由于Pm8基因对大多数菌株表现感病,所以这2个品种除Pm8外,还具有其他抗病基因。偃展4110与天民668对参试菌株的反应型表现一致,其他材料对不同菌株的反应型表现不同。     

甘肃省主要小麦生产品种(系)及抗源材料抗白粉病基因推导分析

选用17个致病力不同的小麦白粉病菌菌系,对64个甘肃省主要生产品种(系)及抗源材料进行了苗期白粉病抗性鉴定,并结合系谱分析推导这些品种(系)所含抗病基因。初步判断陇原932含有Pm5及未知抗病基因;西峰20含有Pm6及未知抗病基因;98保1-2含有Pm8及未知抗病基因;863-13和石7816含有Pm19;天选43等6个品种(系)含有Pm21;兰天13等18个品种(系)对所有供试菌系均表现感病,与其他35个供试品种(系)一致,可能含有未知抗病基因或基因组合。聚类分析支持基因推导结果。     

小麦高配对材料CS-Ph~I的鉴定

为明确小麦高配对材料CS-Ph~I的染色体组成,采用基因组原位杂交和重复序列为探针的荧光原位杂交技术,进行分子细胞遗传学鉴定。利用23个不同毒性的小麦白粉菌菌株对小麦高配对材料CS-Ph~I进行抗白粉病基因推导,以混合菌株进行成株期白粉病抗性鉴定。结果表明,CS-Ph~I中易位染色体为小麦染色体6B与拟斯卑尔脱山羊草的双末端小片段易位。CS-Ph~I与Pm4c或Pm3b的抗谱有些相似,成株期表现对白粉病免疫,CS-Ph~I可用于小麦白粉病抗病育种,其是否为新的基因还需进行综合分析研究。     

白粉病菌侵染后小麦叶片蛋白质变化的研究

利用双向电泳技术,分析了高感白粉病和对白粉病表现免疫的2种小麦在接种白粉病菌前后的叶片蛋白的变化。结果表明:无论抗病小麦Pm3b还是易感小麦Chancellor,在白粉菌接种前后,叶片蛋白都有明显变化。都有部分蛋白消失。对于抗病小麦Pm3b,在白粉病菌接种后,在电泳图谱上还发现诱导产生许多新的叶片蛋白。经统计,在白粉菌接种后,抗病小麦Pm3b的叶片诱导产生至少20个新蛋白。推测可能与小麦受白粉病菌诱导后一些抗性蛋白大量表达有关。     

小麦抗白粉病基因Pm21分子标记辅助选择的应用

白粉病是威胁我国小麦生产最主要的病害之一。筛选和培育抗病品种是防治小麦白粉病的一条安全有效途径。Pm21是目前最有效的抗白粉病主效基因之一,加快其在小麦育种中的应用,对我国小麦生产具有重要的意义。本研究目的在于将普通小麦——簇毛麦易位系92R137中的抗白粉病基因Pm21导入农艺性状好、产量较高、较易感白粉病的农大系列小麦品种中。在92R137与农大系列小麦品种回交一代利用Pm21的SCAR1265标记进行检测,筛选出含有抗白粉病基因Pm21的单株,进行辅助育种应用的研究,经两次回交和两次标记辅助选择,从农大3291/92R137//农大32912组合后代中选出具有Pm21基因且产量性状好的品系13个,从农大3214/92R137//农大32142组合选出9个,从农大3213/92R137//农大32132组合选出35个,从农大3197/92R137//农大31972组合选出8个,从农大3383/92R137//农大33832组合选出15个,从农大3308/92R137//农大33082组合选出2个共计82个进入初步产量鉴定,根据初步产量结果和农艺性状表现选出9个优系参加2005年秋播产量试验。     

普通小麦DH155抗白粉病基因的分子作图及应用分子标记辅助选择将其转移

普通小麦品系DH155对白粉病菌表现高抗。为明确DH155所携带抗白粉病基因的遗传方式及与抗病基因连锁SSR标记,利用DH155与高感小麦品系SN2890杂交获得的F2和F2:3群体进行接种鉴定和遗传分析,发现DH155对白粉菌菌株E09的抗性受1对显性基因控制,暂命名为Ml DH155。BSA和分子标记分析结果显示,Ml DH155与SSR标记Xcfd81和Xcfd18连锁。利用已发表的中国春和粗山羊草D基因组序列开发新标记,进一步将Ml DH155定位于标记Xsdau K525和Xsdau K527之间,其遗传距离分别为0.2 c M和0.8 c M。将DH155与感白粉病优良品系HB133-4和旱10杂交,在F2~F4代,结合优良农艺性状选择、分子标记辅助选择和抗白粉病鉴定,获得3个高抗白粉病且农艺性状优异的株系(SDAU2100、SDAU2101和SDAU2102)。利用14个白粉菌菌株对DH155进行苗期接种鉴定表明,DH155对13个菌株表现抗病反应型。这些菌株对DH155的毒力谱与已知抗白粉病基因Pm2相似,但DH155对Bg78-3和Bg44-5菌株的反应型与携带Pm2的Ulka/8*Cc不同。结合本试验结果和Pm2基因的相关报道,推测Ml DH155可能是Pm2或其等位基因。     

小麦品种汶农14抗白粉病基因的染色体定位

汶农14是近年山东省和国家审定一个半冬性小麦品种。采用来自不同地区的52个小麦白粉菌菌株对汶农14进行抗性鉴定,并利用分子标记分析定位了其抗白粉病基因。汶农14对43个菌株(82.7%)表现抗性反应型,对9个菌株表现感病反应型。这些菌株对汶农14的毒力谱与已知抗白粉病基因Pm2相似,但汶农14对11个菌株的反应与携带Pm2的Ulka/8*Cc不同。此外,利用26个菌株的鉴定结果表明,汶农14与携带Pm46的Tabasco相比,与3个菌株的反应型表现不同。汶农14在成株期对白粉病混合菌株表现高抗。利用汶农14×邯4564的F₂和F_2:3群体进行遗传分析,发现汶农14对E09菌株的抗性受1对显性基因控制,暂命名为PmW14。分子标记分析显示,PmW14与Xcfd8、Xcfd81和SCAR203连锁,遗传距离分别为7.5、1.8和7.7 cM。由于这些分子标记被定位于小麦5DS染色体的5DS-1-0-0.63区间,且与Pm2基因紧密连锁,因此推测,PmW14可能与Pm2位于相同的基因座。     

不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用

小麦6VS·6DL易位系Pm97033和6VS·6AL易位系92R137中的6VS染色体臂来自不同的簇毛麦种质,均表现良好的白粉病抗性,本研究利用分子标记对这2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与Pm21抗白粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stpk-V基因(GenBank登录号为HQ864471.1)的基因组和cDNA序列为基础,在包含至少1个内含子的2个编码区设计引物,从Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增的稳定性,对特异扩增片段测序并重新设计引物,扩增筛选获得2个引物对,其中PK-F1/PK-R可专一扩增6VS·6DL易位系Pm97033及其抗病亲本,而PK-F2/PK-R可同时特异扩增2个不同来源的簇毛麦6VS染色体,但二者间的特异片段具有多态性。利用这2对引物,对系谱中包含6V(6D)和6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系CB037进行检测,发现仅出现与6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段,不存在簇毛麦No. 1026 (Pm97033的6VS供体)的扩增片段。基因组原位杂交结果表明,CB037仅含1对小麦-簇毛麦的易位染色体,用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦染色体为6A,与本研究开发的分子标记检测结果相吻合,表明CB037携带的白粉病抗性基因来自6VS·6AL易位系92R137,其白粉病抗性可能与Pm97033具有不同的遗传基础。     

兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质的创制与鉴定

TaLTP5是从小麦中分离到的一个脂质转移蛋白编码基因。利用基因枪介导法将TaLTP5表达载体pA25-TaLTP5转入抗白粉病的小麦品种扬麦18 (含抗白粉病基因Pm21)中, 旨在选育兼抗全蚀病和白粉病的小麦新种质。对转基因小麦T₀~T₃代植株中引入TaLTP5基因进行分子检测和抗病性鉴定。PCR检测、Southern杂交分析结果表明, 外源TaLTP5基因已转入、整合到3个转基因小麦株系的基因组中, 并能稳定遗传; 荧光定量RT-PCR的分析以及全蚀病菌的接种与鉴定结果表明, 与受体小麦扬麦18相比, 这3个转基因小麦株系中TaLTP5表达量显著提高, 其对全蚀病的抗性也明显增强。对3个转基因株系的Pm21分子标记和白粉病抗性鉴定表明, 外源TaLTP5基因的导入没有影响受体小麦对白粉病抗性, 说明这些转基因株系为兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质。     

Pm52——小麦品种良星99抗白粉病基因的有效性

良星99是黄淮冬麦区和北部冬麦区推广的抗白粉病冬小麦品种,其抗白粉病基因位于2BL染色体,已被命名为Pm52。利用来自不同小麦生产区的123个小麦白粉菌菌株进行抗性鉴定,良星99可抗80%的菌株。2012-2016年连续5个生长季抗性鉴定中,良星99在成株期对接种的白粉菌混合菌株都表现免疫或高抗。采用Pm52基因紧密连锁分子标记Xgwm120和27个菌株对10个利用良星99培育的品系进行分子检测和抗性分析发现,衡4568、邯农2312、中信麦99和DH51302可能携带Pm52基因,而郑麦369和冀麦729的白粉病抗性基因可能与Pm52不同。石U09-4366、XR4429、衡10-5039和农大3486苗期和成株期都表现感病,不含Pm52基因。这些品种的成株期抗性反应与苗期的抗性反应一致。本研究的结果有利于良星99的抗白粉病基因Pm52在育种和生产上的有效利用。     

小麦–中间偃麦草渗入系抗白粉病基因PmCH7124的分子定位

小麦新种质CH7124由八倍体小偃麦TAI8335与高感白粉病小麦品种晋麦33杂交后代衍生而来,在苗期对白粉病菌株E09、E20、E21、E23、E26、Bg1和Bg2表现免疫或高抗,抗病表现与TAI8335及其野生亲本中间偃麦草相似。基因组原位杂交未检测到CH7124含有外源染色体信号。利用CH7124与感病亲本SY95-71和绵阳11的杂交群体接种鉴定和遗传分析证实,CH7124成株期对E09的抗性由1对显性核基因控制,暂命名为Pm CH7124。采用分离群体分组分析法(bulked segregant analysis,BSA)对SY95-71/CH7124的F6群体进行SSR标记扫描,发现抗性基因Pm CH7124与5对SSR标记连锁,与两翼邻近标记Xgwm501和Xbarc101的遗传距离分别为1.7 c M和4.5 c M。利用中国春缺体–四体和双端体材料,将Pm CH7124及其连锁标记定位在小麦2B染色体长臂上。通过分析2BL上其他抗白粉病基因的抗谱、抗性来源、物理图谱位置以及连锁标记在Pm CH7124作图群体中的多态性,认为Pm CH7124不同于2BL上已知的抗白粉病基因Pm6、Pm33、Pm JM22、Ml Zec1、Ml AB10和Ml LX99。     

普通小麦品种Brock抗白粉病基因分子标记定位

为明确利用Brock转育成的小麦抗白粉病品系3B529(京411*7//农大015/Brock, F₆)抗性的遗传基础,将高感白粉病小麦品系薛早和3B529杂交,获得F₁代、F₂分离群体和F_2:3家系。抗病性鉴定和遗传分析结果表明,3B529对E09小种的抗性受1对显性基因控制,暂被定名为MlBrock。利用BSA和分子标记分析,获得了与MlBrock连锁的3个SSR标记Xcfd81、Xcfd78、Xgwm159和2个SCAR标记SCAR203和SCAR112,根据SSR和SCAR标记在中国春缺体四体、双端体和缺失系的定位结果,将MlBrock定位在小麦染色体臂5DS Bin 0~0.63区间上。MlBrock与Xcfd81和SCAR203共分离,与SCAR112的遗传距离为0.5 cM。这些分子标记的建立有利于今后Brock抗白粉病基因分子标记辅助选择和基因聚合。综合抗白粉病基因MlBrock的染色体定位和抗谱分析结果,推测MlBrock很可能是Pm2基因。